文 献 综 述

脂肪酶的研究已有一百多年历史。在20世纪70年代人们把催化长链脂肪酸酯水解或油酸酯类水解的酶类定义为脂肪酶。脂肪酶(lipase E. C. 3. 1. 1. 3) 亦称酰基甘油水解酶,广泛存在于原核生物 (如细菌) 和真核生物(如霉菌、哺乳动物、植物等) 中。脂肪酶的天然底物是甘油酯类,然而研究表明,脂肪酶不仅能催化油脂水解^[1],生产各种脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯；而且在有机相中还能催化酯合成^[2]和酯交换反应^[3],生产医药、化工、食品和化妆品的重要原料,其中有些产品是用化学方法难以得到的, 而在常温、常压下, 酶催化却能一举成功。因此,脂肪酶在油脂加工和有机合成中显示了巨大的应用潜力^[4-9]。它以其来源广,催化功能多的优势, 已成为应用酶中的一枝新秀。

脂肪酶多功能催化作用的开发必须以脂肪酶的底物特异性为基础。脂肪酸特异性是指酶对不同(碳链长度和饱和度) 的脂肪酸所表现出的特殊反应性不同来源的脂肪酶水解甘油三酯的脂肪酸特异性有很大差异，同时这些酶对底物中不饱和脂肪酸的双键位置也呈现不同反应性。位置特异性是指酶对底物甘油三酯中Sn-1（或3）和Sn-2位酯键的识别和水解的反应性。立体特异性一般是指酶对底物甘油三酯中立体对映结构的1位和3位酯键的识别和选择性水解，在有机相中酶促酯合成和酯交换时，酶对底物的不同立体结构也表现出立体特异性。

众所周知, 酶的底物特异性取决于酶分子的结构, 特别是酶活性中心的结构。自1990年由Brady第一次报道了脂肪酶立体结构以来^[10]，到目前为止已有约80种不同来源的脂肪酶立体结构被相继报道。研究表明,来源不同的脂肪酶,其氨基酸组成数目从270～641 不等,其分子量为29 000～100 000。虽然脂肪酶具有广泛的多样性，不同来源的脂肪酶氨基酸序列同源性也较低，但大多数脂肪酶都拥有一些共同的结构特征。与酯酶一样，脂肪酶也显示一个α／β水解酶折叠结构特征。脂肪酶一般拥有一个特殊的保守序列：Gly#8212;X～Ser#8212;X#8212;Gly，对其中的Ser修饰或取代，都会使酶失活。多数脂肪酶活性中心是由丝氨酸、天冬氨酸(或谷氨酸)、组氨酸组成三联体，相互之间丝氨酸通过氢键与组氨键相连，天冬氨酸或谷氨酸也通过羟基形成氢键与组氨酸相连。

通过研究脂肪酶与底物结合物的X一射线晶体学表明：在正常情况下，脂肪酶活性中心隐藏在V型结构中，形成由疏水残基包围的由亲水基组成的脂肪酶亲电区(氧负离子洞)，表面被相对疏水氨基酸残基形成的α一螺旋结构，也就是一个肽环盖子所覆盖，对三联体起保护作用，所以酶催化中心一般不被溶剂和底物所接近。在底物(如醇、酸或酯等)存在的情况下，酶的构象发生变化，”盖子”打开，含有活性部位的疏水部分就暴露出来。”盖子”中α一螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油／水界面的结合能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶活性的降低。”盖子"的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内表面则相对疏水。由于脂肪酶与油／水界面的缔合作用，使盖子张开，活性部位得以暴露，这使得底物与脂肪酶的结合能力增强，此时底物就容易进入疏水性的通道而与活性部位结合，形成酶一底物复合物^[11]。。这就是脂肪酶的界面现象^[12]。由于脂肪酶活性中心和底物结合区域结构差异，使它们具有不同的底物特异性，包括脂肪酸特异性、位置特异性和立体特异性等。正是脂肪酶这种和底物结合的机理，研究脂肪酶对不同结构底物活性的特异性对工业上脂肪酶的应用有导向性的意义。

近年来纳米技术不断发展，纳米材料被运用到越来越多的检测中。纳米金颗粒具有独特的物理、化学性质及生物相容性, 在仿生工程中有许多重要的应用。纳米金(Gold nanoparticles)即指金的微小颗粒，其直径在1～1 0 0 nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性^[13]。以纳米金为基础开发的检测技术具有快速、准确、灵敏、特异性高的特点。由氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。1857年，法拉第对纳米金作了系统的科学研究。发现在其中加入少量电解质后，可使它由红色变为蓝色，终至凝聚为无色，而加明胶等大分子物质后便可阻止这种变化。他的重大发现奠定了纳米金应用的科学基础。研究发现利用吐温-60可在纳米金的表面自我吸附使纳米金稳定，以往的研究报告了吐温-20和含氟表面活性剂在纳米金表面类似的吸附现象^[14]。当体系中加入脂肪酶后，纳米金粒子发生聚集现象。纳米金粒子聚集后粒子间距减小，导致了表面等离子体传播（SPP）模式传播特性改变以及局域表面等离子体（LSP）模式和SPPS模式的相互作用^[15]。其表现为吸收光谱发生红移 ^[16],溶液颜色由红色变为紫色等现象。这种相互作用同时也受到外围环境介电特性的影响^[17]。

本课题通过在纳米金溶液中直接加入吐温80,即作为纳米金的稳定剂又充当脂肪酶的水解底物。当体系中加入脂肪酶，在其催化水解下利用紫外分光光度法对吸光度的测定来进行脂肪酶活性的测定。通过对盐浓度，温度，pH三个条件的优化，在最佳条件下测得脂肪酶活性的动力学与之前本课题组做的吐温60为底物的动力学进行比较，研究脂肪酶对链长相同但饱和度不同的脂肪酸的水解活性特异性及其机理，最终验证课题组之前建立的纳米传感方法对测定脂肪酶特异性的实用性。

参考文献

[ 1 ] Cardenas J ,Alvarez E ,de Castro-Alvarez M-S ,et al. Screening and catalytic activity in organic synthesis of novel fungal and yeast lipases[J]. J Mol Catalytic B :Enzym,2001, 14: 111-123.