文 献 综 述

大肠杆菌K12重组菌r-谷氨酰转肽酶诱导表达条件优化

1、引言shy;shy;shy;shy;shy;shy;

γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT，E.C.2.3.2.2），能够专一的催化γ-谷氨酰基团转移，在生物体中广泛分布^[1-3]。GGT在真核生物和原核生物体内分布不同，具有一定的特异性^[4]。在人体及一些其他高等哺乳动物体内，GGT是一种膜结合的糖蛋白，主要结合在肾、胰、肝、脾和小肠等组织的微绒毛膜上，其中肾中含量最多，其次为胰和肝^[5]；在昆虫中，GGT主要结合在微粒体的膜上^[4]；在植物中，GGT主要分布在质外体和液泡中^[6]。真核生物的GGT在水中是不溶的，但经过有机溶剂或酶处理后可以变成水溶性的。原核生物的GGT在水中是可溶的，且菌属不同分布位置不同，如大肠杆菌的GGT主要存在于细胞周质空间中^[7]；枯草芽孢杆菌中大部分GGT可以直接分泌到胞外^[8]。二十世纪五十年代起，人们就从普通变形杆菌及动物肾脏中提取并纯化了GGT，研究其催化性质。如Talaly等最先从Proteus vulgaris 中提取到GGT并研究其对谷胱甘肽的水解和转肽作用。目前，人们已从很多菌属中分离出了GGT，研究主要集中于E.coli、枯草芽孢杆菌和幽门螺杆菌等。

2、 γ-谷氨酰转肽酶的结构

不同来源的GGT有着相似的结构，均为异源二聚体蛋白，由大、小两个亚基组成。不同来源的GGT，分子量有所差异，小亚基分子量约在21-25 kDa，大亚基分子量约在46-65 kDa^[9]。这两个亚基是由大约580个氨基酸构成的、无活性的GGT前体肽，经过自剪切反应加工形成。GGT的N末端是一个严格保守的苏氨酸，在酶催化反应过程中作为亲核试剂，因此被定义为N-末端亲核水解酶（Ntn-hydrolase family）。

2006年Toshihiro Okada等通过X射线衍射的方法建立了来自于E.coli K-12的GGT的3D结构（PDB code:2DG5），简述了E.coli GGT的基本结构特征^[10]：E.coli K-12 GGT前体蛋白自催化反应将Gln-390和Thr-391之间的肽键切开，生成大小亚基，形成成熟的GGT。前体蛋白上的Thr-391作为亲核试剂，分裂后它成为新的小亚基N -末端，并在之后的酶催化反应中作为亲核试剂。分裂之后，大亚基的C -末端（378-390残基）移开，从而形成γ-谷氨酰基结合的催化口袋（见图1），并有一段柔韧的片段（438-449残基）覆盖口袋，形成盖环序列，该片段亦广泛存在于哺乳动物、植物以及大部分细菌GGT中。当底物或是抑制剂进入催化口袋时，该片段可将溶剂屏蔽于催化口袋外 ^[11]。Kei Wada等人认为该柔韧片段可通过改变底物构象以适应催化口袋，是GGT催化反应所必需的。幽门螺旋杆菌GGT的突变分析表明，改变该片段上残基显著减少其催化活性。

图1 E.coli K-12 GGT的底物结合口袋结构

Fig.1 The pocket structure of E.coli GGT

目前PDB中已公布两个来自枯草芽孢杆菌GGT的3D结构（PDB code：3A75 and 2V36）。Kei Wada等人研究显示^[12]枯草芽孢杆菌的GGT结构中不含有E.coli K-12 GGT中的盖环序列，取而代之的是大亚基的C-末端的额外的残基。但催化中心和底物结合所涉及的残基大多是保守的。枯草芽孢杆菌GGT有很强的耐盐性, 甚至在3 M NaCl溶液中它仍保留了大部分的催化活性。蛋白质的表面酸性基团可以通过增加结合水的能力提高溶解性，从而提高其稳定性^[13]。通过计算静电表面电位显示，枯草芽孢杆菌GGT在高盐条件下仍可以保持其表面负电。由于结合水的能力增强了，溶解度甚至升高了，由此推断枯草芽孢杆菌GGT在高盐溶液中保持水合状态,防止结合无机阳离子，并防止自聚集。