胃癌组织中化疗敏感性相关基因的差异表达及临床意义

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一, 每年有934 000 新增病例,其中三分之二的新增病例出现在发展中国家(中国占42% )，胃癌的预后很差, 5年生存率不足20% 。

胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段的复杂过程,，涉及到多个基因和多种分子水平变化,故在肿瘤基因水平上寻找新的预后指标是目前肿瘤研究的重点。癌基因HER-2/neu又称c-erbB-2或Her-2基因,定位于人染色体17q21 , 编码一种相对分子质量为185 000 的跨膜蛋白, 结构与表皮生长因子受体(EGFR) 相似, 其胞质区具有酪氨酸蛋白激酶(TPK) 活性。HER-2/neu在正常情况下处于非激活状态, 与其特异性配体结合后可调节细胞的分裂、分化和增殖。当HER-2/neu 受到某些致癌因素的作用后, 其结构或表达失控而被激活, 转而具有肿瘤转化活性, 可促使细胞发生恶性转化。目前大量的研究发现, 在多种恶性肿瘤中存在HER-2/neu 基因的异常扩增及p185 的过度表达, 并且与其预后不良有关。因此, 检测肿瘤组织中过度表达的HER-2/neu基因蛋白产物, 有助于从蛋白水平认识肿瘤的本质。

现今对胃癌的治疗包括包括了手术、化疗、放疗、生物治疗和中药治疗，而化疗在胃癌治疗的过程中起着越来越重要的作用，胃癌患者化疗效果不光跟化疗药物有关，同时跟其相关基因有着直接和间接的关系。从恶性转化和肿瘤发展的分子遗传学来看, 胃癌是一种获得性的多阶段的基因病, 它的生长、侵袭、凋亡都和基因相关。60% 的临床实验证明, 基因治疗的最普遍的适应证是肿瘤。而且基因定量检测已经成为研究基因组变异以及由于基因重组所引起的相关疾病的重要手段。大片段的基因组的重复和缺失可以引起致病突变，使用PCR和测序等定性检测方法很难探测到杂合状态的缺失和重复，因此探寻高效、可靠、灵敏的基因定量检测方法是当务之急。在过去的几年中已经相继出现了一些自动高效的技术方法，目前基因检测的方法主要有：荧光定量PCR、基因芯片、液态生物芯片与微流控技。本次毕业设计实验将采用实时荧光定量PCR技术对胃癌组织中化疗敏感性相关基因进行检测。实时荧光定量RT-PCR是检测低丰度mRNA的敏感方法，为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。而理想的内参基因应该满足以下条件：①不存在假基因( pseudogene)，以避免基因组DNA的扩增；②高度或中度表达，排除太高或低表达；③稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；1／2其稳定的表达水平与目标基因相似；3／4不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条件则为: ① 在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异; ②呈现细胞周期依赖的表达; ③定位于X染色体。本次试验将从MRPL19、TBP、RPLP0、IPO8等内参基因中筛选出一个以上内参基因作内参。

铂类药物是常用胃癌化疗药物之一,但不同个体对铂类药物敏感性差异很大，研究提示核苷酸切除修复交叉互补基1(excisionrepair cross- comple-menting gene1, ERCC1) 及乳腺癌易感基因1( breast cancersusceptibility gene 1, BRCA1) 与铂类药物敏感性有关。

乳腺l号基因(breastcancer1，BRCAI)是重要的抑癌基因，位于17号染色体q21，其主要功能是对DNA损伤部位进行重新装置，以及对因DNA双链断裂引起的细胞核损伤进行修复，所以BRCA1基因所表达的蛋白具有维持基因组完整性的功能。在体外化疗药物的敏感性实验显示，胃癌细胞BRCA1的mRNA表达水平与铂类药物化疗效果相关，BRCA1与ERCC1联合预测癌细胞对铂类药物的敏感性比单个基因更准确。

切除修复交叉互补基因1(excisionrepaircrosscomplementgroup1,ERCC1)位于19号染色体的q13．2-q13．3，有10个外显子分布在15 kb长的基因组上。ERCC1主要参与核酸切除修复。。现在的临床证据表明ERCC1可以作为肿瘤预测及预后的标志物。但是不同ERCC1基因型患者其生存率以及对化疗药物的敏感性是不同的，针对ERCCI基因突变的研究，对抗癌治疗是十分有吸引力的。

综上所述，ERCC1、BRCA1与胃癌的发生、预后及治疗反应具有密切关系, 通过检测两者的表达情况可用于指导胃癌的个体化治疗以及生存期的预测。但明确ERCC1、BRCA1的致癌机制以及如何调节两者的表达水平以适应肿瘤治疗的需要, 为肿瘤的预防和治疗提供新方法,将成为今后值得进一步深入研究的问题。

本次毕业设计将围绕胃癌基因表达检测的内参选择、胃癌组织基因表达检测、临床意义分析等方面进行分析研究。而实验的主要内容是提取胃癌病人的肿瘤组织和正常组织、使用RNA提取试剂盒提取总RNA、定量PCR检测基因表达水平、筛选合适的内参、计算基因表达差异、结合临床资料，统计分析基因表达的临床资料等。实验要求我们参与组织RNA提取 、病人资料的查询、数据处理等。研究的技术途径则有RNA提取、cDNA合成、qRT-PCR检测、病历查询、数据统计。

参考文献