文 献 综 述

唾液酸简介

唾液酸是神经氨酸及其衍生物的总称，是一类含有羧基的九碳氨基糖类。1 位的羧基是共有的取代基，使得整个唾液酸分子在生理状态下显示出酸性，具有强有机酸的特性（pKa 2.2）。天然唾液酸类衍生物大约有40 多种。在共有结构的基础之上，根据C-5 位置上的取代基不同又分为四种基本结构神经氨酸 （Neu）、N-乙酰氨基神经氨酸（NeuAc）、N-羟乙酰氨基神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid，NeuGc）和神经氨酸的羟基取代氨基后的衍生物（Deaminoneuraminic acid，KDN）。其中非取代的唾液酸，也就是神经氨酸在自然状态下是不存在的。以四种基本结构为基础在C-4，C-7，C-8，C-9 位置的羟基可结合 O-乙酰基（O-acetyl），O-甲基（O-methyl），O-硫酸基（O-sulfate），O-羟丙酰（O-lactoyl）和磷酸基 （phosphate groups）等不同取代基。还存在不饱和的和自身脱水的结构。如N-acetyl-2,3-didehydro-2-deoxyneuraminic acid（dideoxy-Neu5Ac，Neu5Ac2en），由于双键的存在使环状结构呈一平面。机体内游离唾液酸大部分是以β 构型存在，转运过程中的中间体CMP-sialic acid 保持这种构型。唾液酸与糖蛋白和糖酯结合时是α 构型，通过C-2 位置形成α-糖苷键，形成多种结构的糖缀合物。这些都构成了唾液酸类物质的种类的多样性（Travling et al. 1998）。

唾液酸代谢过程相当复杂。特别是真核生物的唾液酸合成和降解，分布于细胞的不同部分。唾液酸由6-磷酸-N-乙酰甘露糖胺和磷酸烯醇式丙酮酸在细胞质中合成。上步反应的生成物9-磷酸-N-乙酰神经氨酸脱磷酸化后在细胞核内经过CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶的催化和CTP 反应生成CMP-N-乙酰神经氨酸。这种核糖和唾液酸的结合方式是所有唾液酸和其他化合物天然结合方式中唯一的β-连接方式，唾液酸的糖缀合物都是α 型。然后CMP-Neu5Ac 被转移定位到高尔基体或内质网。在那里，被激活的唾液酸在唾液酸转移酶的作用下转移到合适的初期的糖缀合物的寡糖连受体上。连接上的唾液酸在细胞表面成熟的糖缀合物转运前在O 上进行了乙酰化或甲基化修饰，而只有CMP-Neu5Ac 上的N-乙酰基的羟基化修饰在唾液酸被转移到糖缀合物之前发生， 这一修饰使产物CMP-Neu5Gc 定位在细胞质中。唾液酸分解代谢的关键酶为唾液酸苷酶。唾液酸残基由膜结合的唾液酸酶从细胞表面或血清唾液酸糖缀合物中移去。通常在更高等的动物中倾向于降解的糖缀合物被受体介导的内吞作用消耗。溶酶体和内涵体融合后，最终的唾液酸残基被溶酶体中的唾液酸苷酶清除。游离的唾液酸分子（Neu5Ac 或Neu5Gc）通过溶酶体膜被运输到细胞质中。在细胞质中激活重复利用和转移到其他的高尔基体中的新生的糖缀合物。另外，可以在胞质中乙酰神经氨酸裂合酶的作用下被降解成乙酰甘露糖胺和丙酮酸。许多细菌也能产生乙酰神经氨酸裂合酶（Traving and Schauer，1998）。而对原核微生物来说，随着环境的变化唾液酸合成和降解各有偏 重。有些微生物进化出和真核生物完全不同的唾液酸代谢过程，而其他微生物通过半合成途径利用动物细胞合成的唾液酸作为前体进行唾液酸合成（ Vimr and Lichtensteiger，2002）。有些共生微生物或致病性的细菌也利用环境中，也就是宿主的唾液酸，作为碳源、氮源、能源、以及提供合成细胞壁的氨基糖类。（Plumbridge and Vimr，1999）其中E. coli 中唾液酸代谢途径研究得比较透彻研究表明，E. coli 中唾液酸浓度趋于稳定，N-乙酰神经氨酸醛缩酶对菌株中唾液酸浓度起到调节作用（Vimer and Troy，1985 a）。

N-乙酰神经氨酸的研究和生产

N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）是唾液酸（Sialic acid，SA）家族中天然分布最为广泛的一种，也是结构多样的唾液酸类物质的基本结构之一。Neu5Ac 类物质是一种九碳的氨基糖类，在生物界分布广泛，在高等生物体内常定位于糖脂和糖蛋白的末端，是脂多糖和神经节苷脂的主要成分，行使细胞识别和通讯等重要功能，参与免疫应答、免疫反应异常、癌症转移和微生物感染等和人类疾病密切相关的生物学过程。Neu5Ac 类物质的这些生理功能都是以它们的结构为基础的，因此Neu5Ac 及其衍生物在食品、医疗、制药等领域有着广阔的应用前景。比如，Neu5Ac 的结构类似物可用作预防和治疗流感的药物，其中扎那米韦（Zanamivir，4-guanidino-Neu5Ac2en）和奥司米韦（Oseltamivir，达菲）于1999 年被美国药物和食品管理局批准为用于治疗A 型和B 型流感类药物。此外，以Neu5Ac 及其类似物为结构单元的神经节苷脂在改善神经元促进神经恢复上的研究也正在进行，有望成为治疗帕金森及相关脑病的药物。Neu5Ac 的生产方法以提取和化学合成为主，产量低、步骤繁琐、污染严重且成本较高，不适合大规模生产。生物催化作为一种的新的绿色环保的精细化学品生产工艺，由于其自身的优势受到越来越多的重视。当前，关于生物催化法生产Neu5Ac，研究较多的是酶催化法，该法具有过程简便，操作灵活，产物成分简单的特点，但是存在酶纯化难度大、底物价格高、需要加入价格昂贵的辅因子等问题，生产成本较高。全细胞催化，由于不需要繁琐的酶纯化操作，存在完善的辅因子循环系统等优点，能够克服上述缺点，是一种有发展前景的方法。本论文采用两步酶催化法合成Neu5Ac，Neu5Ac醛缩酶一般来源于大肠杆菌K12株的nanA基因。利用重组大肠杆菌过量表达该同源基因，表达效率较高，使酶催化生产Neu5Ac的转化率和产率大大提高，并投入了工业化生产（Mahmoudian et al.1997）。由于大肠杆菌中没有直接以GlcNAc为底物的异构酶，所以要得到该酶的生产用酶源，就必须利用大肠杆菌对来源于其他物种的GlcNAc 2-异构酶基因进行异源表达。目前报道的常用GlcNAc 2-异构酶表达基因为来源于高等生物的肾素结合蛋白基因和蓝细菌基因组中与已知GlcNAc 2-异构酶基因同源性高的基因。这些异源基因在大肠杆菌中过量表达常常会形成包涵体。在使用化学诱导剂诱导表达的系统时，通过表达温度降低和诱导剂量减少的优化，可以减慢蛋白的表达速度，使蛋白有充分的时间正确折叠，能得到可溶性较高的异构酶，并应用于Neu5Ac的生产研究（Tabata et al. 2002）

N-乙酰葡萄糖胺异构酶MIT.9215的研究

使用 2 引物以原绿球藻基因组为模板扩增出9215基因，片段切胶回收后连接到T 载体，然后转化进入E.coli DH5α。挑取转化子，酶切验证。用引物设计的酶切位点对应的核酸内切酶消化前一步验证正确的质粒，然后与相同酶处理的PET-28a 连接，转化E.coli DH5α 。挑取转化子，酶切验证，诱导后进行蛋白电泳和酶活性验证。