小分子醛类化合物分析检测毕业论文
2020-04-08 12:44:19
摘 要
含糖丰富的食品在热加工过程中会产生大量的糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF),不同食品加工后所产生的糠醛及HMF的含量有所差异,但当含量超过标准时就会对人体产生危害,比如人体，肾脏，心脏都会受损。因此，急需开发一种简单，快速和灵敏的方法。人们已经开发了许多方法，包括分光光度法和色谱（例如气相色谱（GC）和高性能液体色谱（HPLC））法。分光光度法更简单，成本更低它们常常受到基质效应的阻碍并且不足选择性。GC-MS经常需要几个分析步骤，包括提取和衍生在分析之前。
我们的实验室最近合成了一种醛反应剂4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素，4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素充当荧光团核心和N-单取代的羟胺基团作为反应性基团。糠醛（F）、还有糠醛类化合物比如：5-羟甲基糠醛（5-HMF）等等都可以通过被标记，比如与4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素缩合反应得到产物。其具体研究内容如下：在乙酸/乙酸铵缓冲体系下，将4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素标记上糠醛；并使用LC-MS确定衍生产物的生成;优化衍生条件，如反应温度、反应时长、反应摩尔比等;测定RSD。
研究结果表明：4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素可以用于微量糠醛类化合物的检测，此方法步骤简单，成本低。
本文的特色是：使用了4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素标记糠醛，从而使糠醛具有了荧光性质，可以通过HPLC-FLD检测出微量糠醛的含量。
关键词：高效液相色谱-荧光检测法；质谱法；荧光衍生；脂肪醛；4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素
Abstract
Sugary food rich in hot working process will produce a lot of furfural and 5 - HMF, produced by different food processing after the content of furfural and the results vary, but when the content is more than standard will cause harm to human body, these compounds on human central nervous system, liver, kidney, heart and other organs concentration has a negative influence over the body absorb certain limit . Therefore, it is essential to develop a simple, fast and sensitive method to determine the presence of fur furfural in different foods. Many methods have been developed, including spectrophotometry and chromatography (such as gas chromatography (GC) and high-performance liquid chromatography (HPLC). On the one hand, spectrophotometry is simpler, it's cheaper and they're often hindered by the matrix effect and they're not selective. On the other hand, ultra-ultraviolet detection (LC-UV) has been used to determine furfurfural in food, and the detection limit is usually 10-3 orders of magnitude much higher than GC/MS. Unfortunately, GC-MS often requires several analysis steps, including extraction and derivation before analysis.
Our lab has recently synthesized an aldehyde-reactive agent,, which can react with the aldehyde groups of furfurals to afford oxime derivatives. Furfurfural (F), 5-methyl-furfurfurfurfurfurfural (5-mf) and 5-hydroxymethyl furfurfurfurfural (5-hmf) can thus can be fluorescently derivatized. The major research contents are as follows:
- Investigate the fluorescent properties of the novel derivatization reagent;
- Monitor the oxime formation reaction between the model aldehyde furfural and reagent using HPLC-FLD;
- To achieve high reaction efficiencies, several derivatization parameters were optimized, such as the reaction temperature, the reaction time, molar ratio of the reagent over aldehyde, etc.
The results show that 4-（（aminooxy）meyhy）-6-ethyl-7-hydroxy-2H-chromen-2-one can be applied for the determination of furfurals with high sensitivity.
Key words: HPLC - fluorescence detection method; Mass spectrometry; Fluorescence derivation; Fatty aldehyde;4-（（aminooxy）meyhy）-6-ethyl-7-hydroxy-2H-chromen-2-one
目 录
第1章 绪论 1
1.1糠醛类化合物的概述及其危害 1
1.1.1糠醛类化合物的来源 1
1.1.2糠醛类化合物的危害 1
1.2糠醛类化合物的分析方法及其特点 1
1.2.1激光拉曼光谱法（ Laser Raman Spectroscopy, LRS） 1
1.2.2高效液相色谱法 1
1.2.3比色分析法 2
1.2.4总结 2
1.2 质谱分析法 3
1.2.1质谱分析概述 3
1.2.2质谱仪 3
1.3高效液相色谱及荧光衍生法 7
1.3.1高效液相色谱概述 7
1.3.3高效液相色谱仪 8
1.3.4荧光现象及荧光衍生 12
第2章 4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素对糠醛类化合物的荧光衍生及HPLC-FLD的检测 14
2.1 引言 14
2.2 实验部分 14
2.2.1 实验仪器 14
2.2.2 药品来源及规格 15
2.2.3实验原理 15
2.2.4实验方法 16
2.3结果讨论 16
2.3.1 4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素的荧光性质 16
2.3.2糠醛与4-氨氧基-6-乙基-7-羟基-香豆素衍生产物峰的确定 18
2.3.4糠醛的还原 22
2.3.5质谱法分析反应产物 23
2.3.6混合糠醛的分离与检测 25
2.3.7相对标准偏差的测定 26
第3章 总结与展望 27
参考文献 28
致 谢 30
第1章 绪论
1.1糠醛类化合物的概述及其危害
1.1.1糠醛类化合物的来源
我们吃的很多食品，它们在生产加工的时候，难以避免会产生糠醛以及它们的化合物[1]。比如说常常看见的5-羟甲基糠醛等等。HMF焦糖化反应的一种中间产物,具有调香增色等作用， 同时也是衡量焙烤食品、蜂蜜、咖啡、 乳制品、水果制品等食品热处理和贮存时间的量度[2]。
1.1.2糠醛类化合物的危害
糠醛类物质会对人的身体造成很多不良影响。研究表明，当剂量较高时，会对眼睛粘膜、上呼吸道粘膜和皮肤产生一定的刺激。过量摄入会导致动物横纹肌麻痹和内脏损伤。此外，５－ＨＭＦ可与人体蛋白质结合产生蓄积性中毒。食用含有过量５－ＨＭＦ的食物可能导致基因突变和ＤＮＡ链断裂，具有潜在致癌风险[3]。
1.2糠醛类化合物的分析方法及其特点
1.2.1激光拉曼光谱法（ Laser Raman Spectroscopy, LRS）
激光拉曼光谱现在的很多检测糠醛的手段相比[4]，它有很多优势：不使用检测样品，因此可以多次检测同一样品。而且它使用同一个频率能检验很多样品。它测定的性能好，特别稳定。维护成本低等优点。
1.2.2高效液相色谱法
（1）高效液相色谱结合紫外可见分光光度法
现在有很多检测糠醛的手段，但大多数都是利用紫外检测器直接检测食品里面的糠醛。这种方法虽然只需要对待检测物质进行简单的前处理，但和荧光高效液相色谱相比，紫外高效液相色谱并不能检测较低含量的糠醛，而荧光检测器比紫外检测器要灵敏的多。
（2）高效液相色谱结合荧光检测器
光检测器比紫外可见检测器要灵敏的多。但糠醛类物质并没有荧光性质，此时我们提出用一种带有荧光性质的物质标记糠醛，进而用荧光高效液相色谱检测糠醛的含量。
1.2.3比色分析法
温克尔比色法是使用剧毒试剂，如巴比妥酸和甲苯胺，必须每天临时配制的方法。以醋酸苯胺为显色剂，用分光光度计通过比色分析定量测定油中微量糠醛[5]。
1.2.4小结
糠醛类化合物的常用检测方法有：激光拉曼光谱法，高效液相色谱法和比色分析法等,其中，荧光检测器有很高的灵敏度，实验操作简单等优点。因此，本试验尝试用高效液相色谱联合荧光检测法（HLPC-FLD）来检测糠醛[6-7]。
1.2 质谱分析法
1.2.1质谱分析概述
1912年，第一台质谱仪被创造，到今天为止，质谱仪的历史已经有106年了。质谱分析是科学领域使用很重要的一个工具，物理，化学，生物等学科都会用到它。最早的质谱仪器被人们用来测定原子的质量，研究电子碰撞，测量同位素的相对丰度等科学领域[8]。从第二次世界大战开始，质谱法受到很大的重视，这也是为了适应原子能工业和石油化学工业的需要。随着仪器的发展和科学的进步，质谱仪的分辨率提高[9]，重现性也很好，因此，质谱分析法成为测定有机化合物结构的一种重要的方法。
20世纪60年代末，色谱-质谱联用的技术变得越来越完善，这使得质谱法的高分辨率与气相色谱法的高效能相结合，再加上有了计算机的应用，提高了只质谱仪器的效能，因此，分析有机物时，特别是组成很复杂时候，这种方法很好用。这些年来，质谱仪器出现了各种类型，离子源的类型很多，在石油，化工，环境等领域质谱仪器都有被用到。
质谱是利用电磁学的原理将化合物电离，成为拥有不同质量的离子，之后，按照粒子质荷比（m/z）的大小依次排列成谱子，把它收集并记录下来。质谱分析法（mass spectrometry, MS）是以质谱为基础建立的分析方法。
质谱法同核磁共振法，红外光谱，紫外光谱相比较，可以确定分子式，灵敏度很高，常常只要微克级别甚至更少量的样品，就可以得到质谱图。依据有机化合物分子的断裂规律，分子碎片峰提供了有机化合物很多结构的信息[10]。
1.2.2质谱仪
质谱仪是用来记录并检测待测物质。它可以测定相对分子质量，分子式和有机化合物的结构分析。
质谱仪按照不同的分类标准可以分为不同的类别，如下表2.1所示。
表2.1 质谱仪的分类
按质量分析器的分类 | 按进样状态分类 |
单聚焦质谱仪 | 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） |
双聚焦质谱仪 | 液相色谱-质谱联用仪（LC-MS） |
四级杆质谱仪 | 毛细管电泳-质谱联用仪（CE-MS） |
离子阱质谱仪 | 高频电感耦合等离子体-质谱联用仪（ICP-MS） |
飞行时间质谱仪 |
质谱仪的组成部分有：高真空系统、进样系统、质量分析器、离子源、离子检测、记录系统 。
（1）进样系统
进样系统的功能是将试样送入离子源。不同的离子源，其进样方式如下表格2.2所示。
表2.2 质谱仪的进样系统
直接进样 | 仪器有一个直接进样杆，将样品直接进到离子源内，缺点是不能分析复杂的化合物体系。 |
间接进样 | 经过GC或者HPLC分离后进到质谱的离子源内部。 |
（2）离子源或离子化室
离子源是质谱仪器的核心，它可以让试样里的原子、分子电离为离子。离子源的性能和质谱仪的灵敏度有很大关系，离子源可以按如下表2.3所示。
表2.3 离子源的分类
离子源名称 | 电子电离源（EI） | 化学电离源（CI） | 电喷雾电离源（ESI） | 基质辅助激光解吸离子源（MALDI） |
工作原理 | 电加热或者钨灯丝加热，使得电子获得能量，电子与分子碰撞，当电子的能量大于试样分子的电离所需要的能量时候，试样分子就会电离。 | 首先是反应器的电离，之后会产生准分子离子峰。 | 电喷雾电离源的原理是利用电位差来产生离子。质谱仪进口和毛细管会产生电位差。 | 基质可以吸收激光产生的能量，并传递给试样，从而使得试样激发。 |
（3）质量分析器
Mass analyzer也叫做质量分离器、过滤器。它可以把离子按质荷比分开。如果遇到不符合条件的离子，将就会被过滤掉。
常用的质量分析器有以下几种，如表2.4所示。
（4）检测器和记录系统
它们可以检测离子流强度，并且记录他们，从而可以得到质谱图。
表2.4 常用的质量分析器
名称 | 单聚焦质量分析器 | 双聚焦质量分析器 | 飞行时间质量飞行器 | 离子阱质量分析器 | 四级杆质量分析器 |
工作原理 | 单聚焦质量分析器由磁铁、真空系统、初射狭缝、质量分析器管、加速电场组成。离子在进入加速电场前能量不是0，所以纵然质荷比相同的离子，也不能聚焦在一起，分辨率不高。 | 它有一个静电场分析器在加速电场和磁场之间，双聚焦质量分析器是由一个固定半径的管道在恒定电场下构成的。它的分辨率得到了很大的提高。 | 它的原理是：离子源里出来的离子动能差不多相同，在电压作用的情况下，质荷比不同的离子到达检测器的速度不同，时间不同。飞行时间质量飞行器的扫描范围大，而且扫描的比较快。 | 离子阱质量分析器的组成部分有：双曲线表面的点极，上下两个端盖电极，它们之间形成阱。离子阱质量分析器的灵敏度特别高，而且容易操作，在有机质谱中，可用于GC-MS。 | 四根棒状电极，它们相互平行，组成了四级质量分析器。四极质量分析器的体积小，扫描特别快，但是它的分辨率不够高。 |
1.3高效液相色谱及荧光衍生法
1.3.1高效液相色谱概述
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是上个世纪六七十年代发展起来的一种新型分离分析技术，现在已是在众多领域[11]，应用极为广泛的化学分析方法。
HPLC是以经典液相色谱为基础，引入了相对成熟的气相色谱的理论，在硬件上采用了高压输液系统，填料颗粒微小的固定相和种类繁多的高灵敏度检测器，具有分离分析速度快，灵敏度高，操作自动化的优点[12-13]。
针对不同的分析样品，HPLC可以连接不同的检测器，比如，应用最为广泛的紫外-可见检测器（Ultraviolet-Visible Detector，UVD）；灵敏度极高的荧光检测器（Fluorescence Detector，FLD）和可用于检测无机离子的电导检测器等。HPLC还可以与质谱检测器联用，将HPLC有效分离热不稳定性化合物的能力与质谱检测器强大的组分鉴定能力结合到了一起，是分析复杂生物样本的标准分离分析系统之一。
在醛类分析方面，有人使用新型BODIPY-肼荧光标记试剂与高效液相色谱法测定了血液样本中的多种脂肪醛，检出限可达到纳摩尔级。有人在检测雨水中痕量的醛类时，使用微固相萃取对样品进行富集和处理，再应用高效液相色谱法进行检测，检出限可达0.15 μg/L。
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