摘 要

本论文应用DNA条形码技术对6种橐吾（共52份样品）进行鉴定研究，通过提取橐吾样品的基因组DNA，扩增ITS2和psbA-trnH序列并进行测序，利用软件CodonCodeAligner V4. 2 对测序峰图进行校对拼接，并对峰图进行质量控制。应用MEGA 5.1 软件对6种橐吾进行种内变异位点分析和种间 Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离计算，基于ITS2序列构建邻接（NJ）系统聚类树。结果表明在NJ聚类树上不同种类橐吾分别聚为独立的分支。因此，ITS2作为DNA条形码序列可以准确鉴定橐吾属不同物种，DNA条形码技术可以为橐吾的鉴定提供新的方法。

关键词：橐吾；ITS2；psbA-trnH；DNA条形码；鉴定

Abstract

Total genomic DNA was extracted from six kinds（a total of 23 samples）of Ligularia sibirica . ITS2 and psbA-trnH sequences were amplified, and purified PCR products were sequenced. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner V4.2. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were calculated using MEGA 5.0. The neighborjoining (NJ) phylogenetic trees were constructed. In NJ clustering tree Ligularia sibirica were independent branch.Therefore, ITS2 DNA barcoding can be identified as Ligularia sibirica, DNA barcoding can be used as identification of Ligularia sibirica provide a new method.

Keywords: Ligularia sibirica; ITS2; DNA barcode; Identification

目 录

第1章 绪论 1

1.1橐吾属药用植物简介 1

1.2 研究目的及意义 1

1.3 DNA条形码技术 2

1.3.1 DNA条形码的概念 2

1.3.1 DNA条形码技术的概念 2

1.3.2 DNA条形码技术的发展及优势 3

1.3.3 DNA条形码技术的国内外研究现状 3

1.4 研究内容及目标 4

1.4.1 研究内容 4

1.4.2 目标 4

第2章 橐吾属药用植物DNA条形码鉴定研究 5

2.1实验原理 5

2.1.1 提取DNA 5

2.1.2 PCR原理 5

2.2 实验耗材 5

2.2.1 实验药品及来源 5

2.2.2 仪器 7

2.3 实验步骤 8

2.3.1 供试品处理 8

2.3.2 DNA 的提取 8

2.3.3 DNA的保存 9

2.3.4 PCR扩增 9

2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测 10

2.3.6 测序 10

2.3.7 数据分析 10

2.4 数据分析及处理 10

2.4.1 橐吾种内变异分析 11

2.4.2 橐吾种间变异分析 16

2.4.3橐吾种间序列聚类分析 17

第3章 结论 20

参考文献 21

致谢 22

第1章 绪论

1.1橐吾属药用植物简介

本实验分别从湖北、云南、广西、广东、浙江等地采集了蹄叶橐吾Ligularia fischeri、舟叶橐吾Ligularia cymbulifera、棉毛橐吾Ligularia vellerea、褐毛橐吾Ligularia purdomii、鹿蹄橐吾Ligularia hodgsonii、大头橐吾Ligularia japonica等6种，其中蹄叶橐吾21份，舟叶橐吾3份，棉毛橐吾2份，褐毛橐吾11份，鹿蹄橐吾7份，大头橐吾8份，试验样品一共52份。橐吾属菊科，是多年生草本植物。根部为肉质，细长而繁多，具有地上部分叶子和位于地下的根状茎，多有52-110厘米高。在七月中旬至八月底开花期间，平均每个花序产生1-8个花茎，每个花序具有20个（至多55个）头状花序，头状花序为淡黄色雌雄同株，主要由蜜蜂等昆虫授粉。卵形瘦果（也称为种子）平均重2.16毫克，它们的冠毛形成比瘦果更长的一簇毛。橐吾种子在短距离或重力作用下被风驱散，它的自由沉降速度在0.86 和1.18 m s⁻¹之间变化。该物种是二倍体（2 n = 60），既有有性生殖，也有无性生殖。橐吾多生长于阳光充足的地方，也可生长在开阔的树冠下，但是会影响甚至减少种子的产生^[1]。菊科橐吾属植物分布广泛，种类众多，全属有 130多种，其中大多数位于亚洲，也有少部分分布于欧洲，我国大约有110种^[2]。民间通常用其根等地下部分作为药材，而其地上部分也可作药用，有利于骨折愈合，方法是捣碎新鲜的地上部分敷于受伤的部位，可用于治疗捻挫伤，也可水煎服用来治疗痔疾^[3]。经多人对蹄叶橐吾化学成分研究表明，蹄叶橐吾确实具有多项药理作用，例如镇咳祛痰、抗炎免疫等。平时可作野菜食用，因其含有多种人体所需的微量元素，有益于身体健康；其姿态别致，叶形优美，具有较高的观赏价值，也可用作观赏植物，同时也可用于工业原料的提取，可从叶中提取单宁。

1.2 研究目的及意义

橐吾属植物根部及根茎能作为中药紫苑或者紫苑的代用品，因而可作药用。但是由于其种类繁多，且来源复杂，使用时多有混淆，不仅同属药用植物容易混淆，而且市场上也存在与细辛药材混淆的现象。就有可能造成药材市场上可能存在许多不良现象，比如大量混用不同的替代品，或使用其近缘植物入药，甚至使用其他假冒伪品药材的现象。因此需要对橐吾属药用植物进行一个准确有效的鉴定。目前，中药材的鉴定主要依赖性状鉴定、理化鉴定等传统鉴别方式。但是这些鉴定方法存在主观性强、稳定性和主观性较差等不足^[4]。随着中药行业的发展，传统的鉴定方法已经远远不能满足各个行业的鉴定需求，因此需要一种能快速有效鉴定中药材的新方法。

如今，DNA 条形码技术已经成为生物鉴定研究的一个新方向，也是被关注的热点。DNA 条形码技术是利用基因组中标准的短DNA 片段，实现对物种的快速有效的鉴别，是一种新的生物鉴别方法^[4]。它能够从基因水平提供一种鉴定依据，克服传统鉴别方式不稳定的缺点。并且可克服传统鉴定对人才经验的过度依赖，能够实现标准化和自动化，可利用其系统优势满足近年来中药材大幅增加的工作量。

本文应用DNA 条形码技术，以ITS2序列为主、psbA-trnH 序列为辅，对橐吾属的6种药用植物，鹿蹄橐吾、蹄叶橐吾、舟叶橐吾、棉毛橐吾、大头橐吾、褐毛橐吾，进行快速、简便、准确地鉴定研究，对保障药材使用的有效性和安全性具有重要的意义。

1.3 DNA条形码技术

1.3.1 DNA条形码的概念

DNA 条形码( DNA barcode) 是生物基因组中的一段短的、标准化的DNA 序列。线粒体基因中的细胞色素氧化酶基因（CO1）作为一个DNA条形码，用于鉴别范围广泛的动物和真菌类群。然而，以一个通用的条形码来鉴定植物一直是一个重要的研究焦点。近年来已经发现了几种DNA条形码（叶绿体DNA的matK、rbcL 和 psbA-trnH序列与核糖体DNA的ITS和ITR2序列），用于鉴定植物物种，包括药用植物^[5]。作为DNA条形码之一的ITS2（内转录间隔区2）序列，是位于5.8S和28 S 核糖体核糖核酸基因之间的真核核糖体操纵元的一部分。从理论上讲，核DNA可以为条形码提供比细胞器DNA更多的信息。它是基于核DNA，具有亲本遗传性，可以提供更多的信息。虽然转录成DNA时ITS2的初级序列和长度可能有很大的差异，但是其二级结构保留了某些在真核生物中普遍存在的特征。此外，据报道ITS2在系统进化中提供了分类学特征，且该区域短小，具有较高的种间差异、普遍性和简洁性，现已普遍采用ITS2序列作为植物鉴别的通用条形码以及在属和种的水平上的系统发生重建。因为ITS2 的DNA转录物中这些高阶结构元素显著地促进了比对的保真度，所以ITS2分子在系统发生重建中的使用更加频繁。此外，ITS2是中草药条形码和鉴定的最常用的区域。因此ITS2区域是一个很有潜力的分子标记，可用于快速分类分类。本文也采用了基因间隔区psbA-trnH序列作为DNA条形码，因为它是分子系统学中编码rbcL序列和matK序列之后使用得最广泛的非编码条形码。本研究以ITS2序列为主，psbA-trnH序列为辅作为DNA条形码来区分药用橐吾的几种不同样品，以保证市场药用安全。

1.3.1 DNA条形码技术的概念

DNA 条形码其既具有稳定的种内保守性，又包含足够的种间遗传变异，可以用于物种的分子鉴定^[6]。因DNA足够变异又相对保守等优点，DNA 条形码技术可以通过对DNA 序列进行分析，实现对物种的快速有效的鉴别，从而创建一种新的生物身份识别系统^[6]。与传统的药材鉴定方法相比，DNA 条形码技术不受物种遗传因素、生长阶段、生长环境等内在及外部条件的影响，操作方便，易于标准化和自动化，准确性和有效性高，可以一次性迅速鉴定大量植物中药材。该技术已经广泛用于对动植物、真菌等物种鉴定，不仅极大地促进了生物分类学的发展，而且推动了生态学、生物多样性评估及分子系统学等领域的发展。

1.3.2 DNA条形码技术的发展及优势

2003年加拿大科学家Paul Hebert 等人首次引入了DNA 条形码技术的概念^[7]。自从2003年DNA 条形码提出以来，就一直迅速发展。截止2017年6月，BOLD 极影收录6336819条DNA 条形码序列，其中正式描述的动物DNA 条形码序列178852条、植物条形码序列65942条、真菌和其他生物DNA 条形码序列20922条，且DNA条形码序列在不断地增加^[5]。随着已经收录的各物种DNA 条形码的日益增多，技术也逐渐成熟，并向着多维度和综合分析的方向发展，对全球物种进行编码的假想也正日益被广大学者接受，未来DNA 条形码很有可能成为各物种鉴定通用的常规手段。DNA 条形码技术鉴定能发展如此迅速，因其打破了传统鉴定方法的框架，掀起了物种鉴定的巨大改革浪潮。

DNA 条形码技术具有以下几个优点：（1）只选用一个或少量几个基因片段即可对某个属、科甚至几十个科的绝大部分物种进行准确鉴定；（2）鉴定准确快速，效率高，可一次鉴定大量物种；（3）不易受生物遗传因素、生长阶段、环境等内外部条件影响，重复性和稳定性相较来说很高；（4）实验过程操作方便快捷，操作规范标准，易实现物种鉴定标准化和自动化；（5）对研究人员的经验的技术能力没有很高要求，可在短时间内掌握DNA条形码技术。（6）信息可进行集中统一管理，可实现数字化，以弥补仅以形态描述的不足，实现共享^[8]。

1.3.3 DNA条形码技术的国内外研究现状

DNA条形码是一种新的技术，它使用标准化的基因组区域来区分物种。由于其多方面的优势，它已被普遍接受作为一种有效的物种水平鉴定工具。DNA 条形码作为新兴技术发展迅速，，这个概念最早在2003年由加拿大科学家Paul Hebert 等人提出。概念一经提出，就得到了广大科技界和社会中研究者的积极响应。随后在动植物、真菌等不同生物种群的鉴定中得到了广泛应用，确立了不同标准的DNA 条形码。2004年，生命条形码联盟(consortium for the barcode of life, CBOL)在美国华盛顿宣告成立，2005年2月, 生命条形码协会第一次国际会议在伦敦召开。2007年9月在台北召开第二次及2009年11月在墨西哥召开第三次国际DNA 条形码会议。DNA 条形码技术可以利用一段或几段标准DNA 序列实现动物、植物和真菌物种的快速鉴定，该技术将是今后生物物种鉴定发展的必然趋势^[8]。

在DNA 条形码的概念出现之后，我国学者就开始关注这项技术。肖金花、马兰、陈士林、王剑峰、莫帮辉等分别对DNA 条形码技术开展了研究。其中Chen 等^[10]提出了以 ITS2 主,psbA-trnH 为辅的药用植物条形码鉴定体系。

1.4 研究内容及目标

1.4.1 研究内容

采用改良的DNA 提取试剂盒法进行橐吾样品的DNA 提取，然后对样品DNA 进行ITS2和psbA-trnH序列扩增，琼脂糖凝胶电泳检测进行测序，对扩增后的序列信息进行分析，通过数据分析，鉴定不同基原的种间种内变异情况，以区分不同种橐吾样品。

1.4.2 目标

本研究通过利用DNA 条形码技术对橐吾属的6种药用植物进行鉴定研究，建立橐吾DNA 条形码鉴定体系。

第2章 橐吾属药用植物DNA条形码鉴定研究

2.1实验原理

2.1.1 提取DNA

细胞核内的染色体DNA分子，又叫总DNA，其主要包括基因组内DNA（genomic DNA）等，这类DNA是基本遗传物质和载体，也是生物学研究的基础。提取DNA的方法有很多种，其都是基于细胞裂解的方式，而细胞裂解的方式主要有三种^[11]，包括化学法如异硫氰酸胍法、碱裂解法。物理法如冻融法、超声波法、玻璃珠法、研磨法等。生物法主要为酶解法。将细胞裂解后，包含核酸的细胞质流出，根据核酸相应分离纯化方式的不同，纯化所用的材料主要有硅质材料、阴离子交换树脂等。化学法主要有操作简单，分离效率高等优点，故一般采用化学方法提取DNA，对于细胞破碎较困难的植物材料，可用酶解法辅助^[12]。

2.1.2 PCR原理

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR技术的主要优点是定量简单，灵敏度高，准确度高，分析速度快，重现性好，质量控制好，污染最小^[13]。

2.2 实验耗材

2.2.1 实验药品及来源

本实验通过野外采集、市场购买等方式获取样品，经过湖北中医药大学胡志刚副教授鉴定，样品保存在武汉理工大学化学化工与生命科学学院中药资源与分子鉴定实验室。样品包含6种橐吾，其中蹄叶橐吾21份，舟叶橐吾3份，棉毛橐吾2份，褐毛橐吾11份，鹿蹄橐吾7份，大头橐吾8份，试验样品一共52份。详见表1

表2.1 样品信息表

2.2.2 仪器

表2.2 试验主要仪器表

2.3 实验步骤

本实验的操作步骤主要包括橐吾样品的处理、DNA的提取、PCR扩增、电泳、测序、数据处理，详细步骤如下^[14]。

2.3.1 供试品处理

将橐吾样品放入装有干燥剂的密封袋，做好标记，干燥通风处保存，以待备用。

2.3.2 DNA 的提取

本实验采用DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech Co. ,China)法，具体步骤如下：

注：在实验开始之前，必须把所有与样品直接接触的实验器材用具进行灭菌处理，防止橐吾样品DNA 的交叉污染。

1. 在GP1中加入适量β - 巯基乙醇，然后将GP1置于温水浴中，保持65℃恒温预热。

注：GP1为裂解液，β - 巯基乙醇有还原性，加入体系中起到抗氧化的作用，能防止核糖核苷酸被空气氧化。

1. 取橐吾样品20-30mg，使用球磨仪研磨2min。研磨结束后，向体系中精确加入700 µL预先在65℃水浴中加热的GP1，混匀后放进65℃ 水浴加热约30分钟，过程中摇匀样品数次以得到混合均匀的混合物。

注：橐吾样品在研磨前要先进行处理，例用剪刀和镊子剪碎，使用完用浸润了酒精的脱脂棉球进行擦拭，以防不同橐吾样品DNA 交叉感染。在放入钢球前，要先对钢球进行擦拭，完全干燥后再放进样品中，防止粘黏样品。