摘 要

目的：检测POLR2E基因上的rs3787016位点的多态性在湖北地区胃肠道癌人群与正常对照组中的分布，探寻其与胃肠道癌发生的相关性。

方法与结果: 提取胃肠道癌患者以及正常人群的外周血细胞基因组DNA，采用PCR-RFLP 技术检测460例胃癌患者、426例结肠癌患者、361例直肠癌患者以及800例正常对照POLR2E基因rs3787016位点的单核苷酸多态性。结果显示POLR2E rs3787016 T等位基因增加了中国人的结肠癌风险，而在胃癌和直肠癌中,rs3787016位点在病例组和对照组中的分布没有显著性差异。除此之外，rs3787016基因型的logistic回归分析显示，TT和TC基因型携带者比CC基因型患结肠癌的风险更大（TT CT vs CC：p=0.001,OR[95%CI]=2.003[1.399-2.869]。以上结果说明，POLR2E基因rs3787016 Cgt; T突变显著增加结肠癌的易感性，但对胃癌和直肠癌没有显著影响。进一步的荟萃分析显示，rs3787016与总人群癌症风险无关，却与高加索人的癌症易感性有关，并且还会显著增加总人群患前列腺癌的风险。

结论：在湖北地区的中国人群中， rs3787016可能与结肠癌发病风险相关，但可能与胃癌和直肠癌的发病没有相关性，同时rs3787016可能作为预测高加索人群患癌风险以及结肠癌风险的一个生物标志物。

关键词：单核苷酸多态性；POLR2E基因；rs3787016；胃肠道癌；遗传易感性。

Abstract

Objective: To detect the polymorphism of rs3787016 locus on POLR2E gene in the gastrointestinal tract cancer population and the normal control group in Hubei Province, and to explore its correlation with gastrointestinal cancer.
Methods and Results: Genomic DNA of peripheral blood cells was extracted from patients with gastrointestinal cancer and normal controls. PCR-RFLP was used to detect POLR2E gene rs3787016 in 460 patients with gastric cancer, 426 patients with colon cancer, 361 patients with rectal cancer, and 800 normal controls. The single nucleotide polymorphism. The results showed that POLR2E rs3787016 T allele increased the risk of colon cancer in Chinese, while in gastric cancer and rectal cancer, there was no significant difference in the distribution of rs3787016 between the case group and the control group. In addition, rs3787016 genotype and logistic regression analysis showed a greater risk of TT TC genotype and CC genotype than colon cancer (TT CT and CC, p = 0.001, OR [95% CI] = 2.003 [1.399-2.869] The above results indicate that POLR2E gene rs3787016 Cgt; T mutation significantly increased the susceptibility of colon cancer but had no significant effect on gastric cancer and rectal cancer. Further meta-analysis showed that rs3787016 and the total population of cancer Risk is irrelevant, but it is related to the cancer susceptibility of Caucasians, and it significantly increases the risk of prostate cancer in the general population.
Conclusion: In the Chinese population in Hubei, rs3787016 may be associated with the risk of colon cancer, but may not be related to the incidence of gastric cancer and rectal cancer, and rs3787016 may be used as a biomarker to predict cancer risk and colon cancer risk in Caucasians.

Key words: single nucleotide polymorphism (SNP); rs3787016 locus of POLR2E gene; gastrointestinal cancer; genetic susceptibility.

目 录

第一章 绪论 1

1.1胃肠道癌的现状 1

1.2胃肠道癌的发病因素 2

1.3 LncRNA与POLR2E基因 3

1.3.1 LncRNA(Long non-coding RNA, lncRNA,长链非编码RNA) 3

1.3.2 POLR2E基因（RNA聚合酶II多肽E基因） 4

1.4 癌症的遗传易感性研究 4

1.4.1 SNPs ( single nucleotide polymorphisms ，单核苷酸多态性) 4

1.4.2 SNPs 的研究方法 5

1.5 研究的目的及前景展望 6

第二章 材料和方法 7

2.1 实验器材 7

2.2 主要试剂 7

2.3 样本采集 9

2.4 样本DNA 的提取 9

2.5 DNA 浓度及纯度检测 10

2.6 POLR2E基因部分序列的扩增及PCR-RFLP 法检测SNPs 10

2.6.1 POLR2E基因各单核苷酸多态性的特点 10

2.6.2 PCR 引物及酶切错配引物的设计 10

2.6.3 PCR 反应条件 11

2.6.4 各SNPs 的酶切情况 11

2.6.5 DNA跑胶结果 11

第三章 结果 14

3.1等位基因频率和基因型分布结果 14

3.2荟萃分析POLR2E基因rs3787016C＞T变异与癌症风险之间的关联 16

第四章 讨论 21

第五章 结论 23

参考文献 24

致谢 26

第一章 绪论

癌症已经成为危害我国人民健康的主要疾病,并且以它极高的死亡率成为医学上亟待解决的一大难题。胃肠道癌又可细分为胃癌、结肠癌和直肠癌三种，胃肠道肿瘤是最常见和最主要的恶性肿瘤，并且已经成为全球主要的医疗和经济负担。研究表明，一个人患癌症与很多种因素有关，而且过程非常复杂。它与吸烟、饮酒、感染、环境污染、不合理的饮食和遗传密切相关。癌症的发生是遗传和环境共同作用的结果，鉴定出一些与癌症遗传发生相关的标记（如：单核苷酸多态性）势必有利于癌症发生的早期预测和诊断。有研究证实，LncRNAs中的单核苷酸多态性（SNP）在肿瘤发生中也起着重要作用^[1,2]。之前的研究已经表明POLR2E基因上rs3787016位点可能与癌症的发生存在相关性^[3,4,5]。本实验旨在研究POLR2E基因rs3787016位点上的SNPs 与患者胃肠道癌的发病率的易感性，为人类胃肠道癌的诊断与防治提供理论基础。

1.1胃肠道癌的现状

目前，胃癌以及肠道癌的发病率和死亡率在所有癌症中都是名列前茅。除此以外，癌症发病与死亡分布图显示，发达国家遭受癌症的危害要比发展中国家小得多。胃癌是非工业化国家最常见的疾病，结直肠癌是西方国家的主要胃肠道恶性肿瘤。根据最新的统计，在中国超过增加的新的癌症病例总数的20%，但癌症死亡的人数已超过世界中的死亡总人数的25%。由于大多数发展中国家包括中国的医疗服务水平还比较低，癌症患者存活率都要低于其他发达地区。

就胃癌的发病率而言，我国西北和东部沿海地区明显高于南部。其病因主要与可纠正和可预防的生活习惯有关，如饮食（包括肥胖）、体育活动、吸烟和饮酒和卫生。长期食用盐腌的人胃癌远端胃癌的发生率较高，这与食品中亚硝酸盐、真菌毒素、多环芳烃等致癌物含量高有关^[6]；吸烟者胃癌的风险比不吸烟者高50%；预防和治疗幽门螺杆菌感染可显著降低胃癌的发生率^[7]。胃癌的筛查、早期发现和治疗需要高端医疗设施、内窥镜专业知识和国家财政资源的重大投资。这种方法目前只有在富裕的工业化国家才有可能实现，如日本（以及一些西方国家），这也进一步加剧了欠发达地区饱受胃癌困扰的现状。

肠癌易误诊。早期粪便增多时，便有血液和粘液，容易误诊为痢疾、肠炎或痔疮，从而失去早期根治的机会。2017年美国癌症统计数据显示，1976~2014年结直肠癌患者死亡率下降了51%，这个结果着实让我们受到鼓舞。但根据美国癌症协会发表的最新研究，尽管老年人患结肠癌几率有所下降，可青年人发病率却明显在增加。据调查，肠癌发病率自20世纪80年代以来一直在上升，90后人群的发病率达到了50后在相同年纪时的两倍。自21世纪初至今，尽管年龄在50岁以上人群结肠癌发病率有所下降，但青年发病率一直呈上升趋势。更可怕的是，中国大肠癌年轻化的趋势比美国更明显，结直肠癌的平均发病年龄为48.3岁，而美国白人为69.8岁，相比起来早了20多年 。

近年来，我国年轻人患胃癌的人数在持续增加。胃癌发病率在19-35岁年龄段较30年前增加了一倍。胃癌早期无明显症状，90%的胃癌患者仅在中晚期开始接受治疗，导致5 年生存率小于20%。大肠癌的发病总数也越来越大。胃肠道癌的发病率和死亡率虽不如肺癌那么高，但是也已经成为了危害现代人健康的一大杀手。国际抗癌联盟认为，1/3的癌症可以在早期阶段被治愈。据统计，有效的早期筛查和干预治疗可使癌症的发病率降低60%，死亡率降低80%。病患5年内生存率，做早期筛查（73%）比不做早期筛查（46%）要高出27%。鉴于此，癌症早期诊断的作用就尤为突出。如果能够在肿瘤发生的早期阶段做出准确的诊断并提供合适的治疗方案，相信可以大大降低癌症患者的死亡率，同时减轻患癌期间病人遭受的痛苦，这必将是一个极富价值的研究成果。

1.2胃肠道癌的发病因素

癌症是一种内源性疾病，由于细胞自身在分裂过程中产生了错误复制，这种错误随着时间逐渐积累，最后形成癌变。虽然DNA突变的概率很小，但有些人在中年时很容易发现癌症，这是突变累积不可避免的结果。胃肠道癌喜发于50岁以上年龄段，据统计男女发病率之比约为2：1。结直肠癌的病因与生活方式、遗传、大肠腺瘤等密切相关，其发病率由高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠和横结肠。近年来，有向近端（右半结肠）发展的趋势^[8]。发病年龄趋于老龄化，男女比例为1.65：1。

胃癌的发生主要与饮食习惯、生活习惯、遗传质量、环境因素、心理因素等有关，与慢性胃炎、胃息肉、胃粘膜异形性、肠化生、术后残胃、慢性幽门螺杆菌感染等也有一定的关系。胃癌常发于胃窦，胃的小曲率次之。根据癌组织浸润的深度，可分为早期胃癌和进展期胃癌（中晚期胃癌）。在胃癌早期，其症状常常很难感知，如突发性的上腹部疼痛不适、嗳气、泛酸盐、厌食，和一些胃十二指肠溃疡或慢性胃炎的症状。

结直肠癌主要包括结肠癌、直肠癌以及肛管癌。肠粘膜表面病变形成大肠息肉，俗称肠结表面的“肉疙瘩”。如果我们的肠中有息肉，自身是无法感觉到的，它需要通过直肠检查、肠镜检查或其他疾病的体检发现。息肉恶化后会逐渐发展成为腺瘤和腺癌。据调查，约有80-95%的结直肠癌是由肠息肉“进化”而来。“进化”的快慢因人而异，少则5年，多则10年。一经发现，往往就已经处于中后期阶段。统计数据的结果表明，大多数50岁以下的原发性结直肠癌患者初次诊断已变现出明显症状，曾经有20岁以下被确诊的患者，其后半年内就病逝了。诱发癌症的条件是外源性和内源性的，但总体而言，生活方式和饮食习惯对结直肠癌的影响最大，仅有3%～5%的结直肠癌来自遗传，如果父母双方都患有上述两种大肠癌，他们的孩子有高达50%的可能患上同样的癌症。考虑到外源性因素，与非吸烟者相比，吸烟可使结直肠癌的风险增加13%。荟萃分析表明，与非饮酒者或偶尔饮酒者相比，适度饮酒（1-4杯/天）和大量的酒精摄入（＞4杯/天）将增加结直肠癌的发病率分别为21%和52%。此外，每100g/d的红肉摄入增加了结直肠癌的风险29%，而50g/d肉类摄入量的增加会增加21%的疾病发生率，尤其是男性。此外，最近的一项大型队列研究表明，超重的男性在中年时患结直肠癌的风险比不超重的男性高出两倍。

尽管大量数据揭示了导致胃肠道癌发生的有关因素，但是目前还未有行之有效的检测方法来进行胃肠道癌的早期筛查。癌症的表观遗传学研究表明，癌症的发生是原癌基因和抑癌基因相互作用的结果，是一个多步骤多阶段的慢性过程。大量的研究数据显示，SNPs使不同人群的癌症易感性出现差异，表明其与癌症的遗传易感性存在某些关联。因此，对于SNPs 以及与其相关的基因与酶的调控方式的研究，对癌症的早期筛查和其分子机制的探索具有重要意义，将会给癌症的诊断和治疗带来新的机遇。

1.3 LncRNA与POLR2E基因

1.3 .1 LncRNA(Long non-coding RNA, lncRNA,长链非编码RNA)

转录组分析表明人类基因组的大部分被转录，然而只有少数转录物被翻译成蛋白质。非编码蛋白的转录，称为非编码RNA（ncRNA），通常被归类为管家和调节ncRNAs。组成型表达的管家ncRNA包括转移小核、小核RNA和核糖体。 在调控型ncRNA中，至少有两种类型，第一种为短ncRNAs，包括microRNA、小干扰RNA和piwi相互作用RNA；第二种则是长链非编码RNA（lncRNAs）。 尽管最近的研究揭示了短ncRNAs功能的重要性，但对构成大多数转录的lncRNAs却知之甚少。

长链非编码RNA（lncRNA）是非蛋白编码转录物，其范围从200至100kb，涉及基因调控和生物过程的所有方面。LncRNAs可以在不同水平上调节基因表达，包括染色质修饰^[9]、转录和转录后处理^[10]。许多lncRNA在细胞稳态和增殖中具有调节作用，而一些lncRNAs可能在细胞凋亡中起作用^[11]。 LncRNA由RNA聚合酶（POL）II/POL I以及RNA Pol III转录，参与不同的细胞功能。最近的研究已经证明lncRNA在癌发生中具有重要作用。从癌细胞的转录、转录后到表观遗传水平，lncRNA都参与了重要细胞信号传导途径的调节。 LncRNA在不同的机制中的作用，包括诱饵，脚手架和指南。LncRNA的异常表达在某些肿瘤中，被认定为早期事件。LncRNA芯片显示，某些lncRNA可帮助胶质瘤癌变，如已知的lncRNA在肺癌、乳腺癌和肝癌的发展中具有重要作用。

解开控制癌症发生和发展的基因表达网络是至关重要的，但是基本上还没完成。随着RNA-seq技术和计算生物学的革新，长链非编码RNA（lncRNA）正在被快速识别和表征。最近的研究结果表明lncRNA与癌症发展的连续步骤有牵连。 这些lncRNA与DNA，RNA，蛋白质分子和/或它们的组合相互作用，作为染色质组织中的基本调节因子，作用于转录和转录后调控。它们的错误表达使癌细胞具有启动、生长和转移的能力。近年来，大量的lncRNA已被鉴定，越来越多的证据表明lncRNA在多种生物学过程中起着关键性的作用，并且lncRNA的功能紊乱与多种疾病有关。因此，了解lncRNA在疾病中的作用，识别候选lncRNA在疾病诊断、治疗和预后方面具有重要意义。

据报道，lncRNA功能障碍与癌症、心血管疾病及神经退行性疾病等多发性疾病都有关联。例如，lncRNA PCA3是一种高前列腺癌特异性分子，PCA3评分有可能成为前列腺癌的侵袭性生物标志物；研究证实尿沉渣中的lncRNA UCA1对膀胱癌的诊断具有高度特异性和敏感性，提示UCA1是膀胱癌诊断的潜在生物标志物；戈迪奥和其他人已经发现，lncRNA BCAR4可能是治疗雌激素抵抗乳腺癌的潜在靶点。这些研究表明，lncRNA有助于了解疾病，并帮助识别在疾病诊断、治疗和预后中的潜在分子。因此，lncRNA与疾病相关的研究正成为lncRNAs和疾病的重要课题之一。

1.3.2 POLR2E基因（RNA聚合酶II多肽E基因）

有研究表明，PORR2E基因参与编码RNA聚合酶II的第五个主要亚基，其负责真核生物中信使RNA的合成^[12]。该亚基由另外两种DNA 指导的RNA 聚合酶共享，并以超过其他聚合酶亚基两倍的摩尔量存在。进一步研究发现，该亚基与肝炎病毒反式激活蛋白之间存在相互作用，从而表明转录激活因子和聚合酶之间的相互作用可通过该亚基发生。

转录激活因子，主要有以下两种定义：1.一个转录因子家族，激活基因表达的方式是通过识别和结合环腺苷酸应答元件来实现的，而环腺苷酸应答元件在很多病毒和细胞的基因启动子中均有存在; 2.促进基因转录的因子，通过与特定DNA序列结合发挥作用。

信号转导和转录激活因子STATs(Signal Transducers and Activators of Tran-scription)作为一种特殊的DNA结合蛋白，自90年代初被首次发现以来，凭借其自身特有的激活模式以及多种生物学效应逐渐引起越来越多科学家和学者的关注。STATs存在于细胞浆中，在受到细胞外信号诸如生长因子、细胞因子等刺激激活后，其结构会发生变化，形成一种能够通过核孔的二聚体。当它转移到核内之后，能够与对应的特定靶DNA启动子序列结合，通过对有关基因转录的促进，来实现对细胞的生长、分化及凋亡的调节，与肿瘤的发生、发展及恶性生物学行为密切相关。

1.4 癌症的遗传易感性研究

1.4.1 SNPs ( single nucleotide polymorphisms ，单核苷酸多态性)

分子标记揭示了DNA水平的多态性，现已成为动物遗传学的关键参与者。 然而，由于各种分子生物学技术的存在以及某些可能产生的各种生物学影响，存在着多种多样的生物学技术，根据目的必须根据这些种类进行选择。当使用分子标记进行基因研究时，必须考虑两个要点。从分子生物学家的角度来看，基因分型过程应该尽可能简单，成本尽可能低，以便生成通常必需的大量基因分型数据。 从统计学家的角度来看，根据要进行的分析类型，一些特征是重要的，例如优势关系，信息内容，中性，地图位置或标记的遗传独立性。 无论选择哪种系统，数据当然必须尽可能可靠。

SNP 是一种DNA 的多态性，是在整个基因组水平上，因为单个核苷酸的突变引起的，其在基因组中的变异形式非常丰富，包括单碱基的转换或颠倒以及单个碱基的插入或缺失，占人类基因组中遗传多态性的90%以上。