1、目的及意义（含国内外的研究现状分析）

近年来，植入体材料的研究成为生物医药领域的一大研究热点，其中由植入体材料所引起的细菌感染现象迫切得到解决。金属材料植入人体时可能带入空气中、术者或患者体表的葡萄球菌等病原体，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是引起骨科植入器械感染的主要细菌，患者术后也可能因常见的皮肤软组织感染、呼吸道感染或泌尿生殖道感染等引起植入物相关感染。植入物表面出现细菌粘附、繁殖及形成生物膜，可能预示着感染的发生，引起局部组织破坏、病原体的全身播散和植入物的失效，导致严重疾病甚至死亡。研制一种既具有良好生物相容性，又具有抗细菌感染的新一代结构/功能一体化的医用金属植入材料，具有重要的临床应用价值。

在目前的研究中，研究的较多的是表面改性抗菌金属植入材料，主要通过有机和无机抗菌剂进行表面修饰，让传统植入材料拥有不同程度的抗菌性能，一些金属离子Ag、Cu，还有一些抗生素类的药物,它们通过破坏细菌的细胞壁或细胞DNA、蛋白质的合成, 从而达到抗菌的目的。王紫琴利用MEVVA离子注入技术,对生物医用金属材合金料进行表面改性,分别系统研究了Cu和Ag离子注入对其抗菌性能、显微硬度、摩擦磨损性能和耐腐蚀性能的影响,结果表明Cu和Ag具有良好的抗菌性能。王国慧等利用冷冻和热氧化法制备了一种新型的表面改性的仿生多孔钛材料，具有良好的抗菌性能和骨融合性。只利用抗菌金属材料有时并不能取得很好的抗菌效果，部分细菌仍会在植入体表面形成生物膜从而难以完全消除。利用可以降解细菌蛋白质的蛋白酶可以很好地解决这一问题。

木瓜蛋白酶是一种从番木瓜中提取的蛋白水解酶,它呈现抗炎,抗菌和抗氧化剂的属性,可用于大皮肤病变的治疗。在组织再生中,这种天然产物也有助于减少细菌生长,减少分泌物,增加肉芽组织形成。木瓜蛋白酶活性部位含有巯基，对酯和酰胺类底物表现出较高的活力。为了在植入体上应用木瓜蛋白酶，我们拟将其负载到磁性微珠上，从而利用磁场将木瓜蛋白酶靶向到植入体处。因为木瓜蛋白酶表面含有较多的组氨酸，可与镍离子螯合，可以通过金属螯合技术，在表面修饰有镍离子的磁性微球进行木瓜蛋白酶的固定化。金属离子鳌合亲和层析（IMAC）是近二十几年发展起来的一种新的分离技术。IMAC载体结合的过渡金属离子与蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基结合,可以使蛋白质牢牢吸附到载体上,目前认为起主要作用的是金属离子与咪唑基团之间形成的配位键。IMAC目前广泛用于蛋白质和重组表达蛋白His6-tag融合蛋白的分离。曾力希等以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体,利用金属螯合配体(IDACu2 )与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理,定向固定了木瓜蛋白酶。

从木瓜中纯化分离得到木瓜蛋白酶，将其金属螯合到磁性纳米微粒（MNPs）得到固定化酶，这样不仅能提高其酶活力，还能因为磁性微珠在磁场中形成的磁性响应到达靶向位点因而形成靶向响应，因而更好的降解细菌蛋白质从而达到抗菌的目的。固定化酶是通过物理或化学的方法，将酶分子负载到载体上，让它既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，能够重复使用，是酶制剂中的一种新剂型。在固定化酶中，酶需要载体材料进行负载，载体材料的结构和功能对固定化酶的各种性能存在很大的影响。李丽娟等在其综述中说明了介孔材料、纳米材料、磁性材料、天然高分子材料在固定化酶中各自有其优缺点及应用，不同的载体材料对固定化酶的性能存在不同的影响。在木瓜蛋白酶的固定化中，有多种载体被采用，如金属螯合载体、壳聚糖微球、胺化聚苯乙烯载体、多孔硅球等。李红等以壳聚糖微球为载体,用吸附-交联的联合固定化方法制备固定化木瓜蛋白酶,并研究了木瓜蛋白酶的最佳固定化条件。贺枫等用载体交联法制备了甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶，结果表明固定化木瓜蛋白酶的热稳定性和耐热性得到了显著提高。为达到在磁场中靶向响应的目的，我们主要采用磁性微球作为载体，它是一种内部含有磁性金属或金属氧化物的超微颗粒从而具有磁响应性的高分子微球。与其它载体材料相比，磁性微球具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等优点，可以通过共聚表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基(如羟基、羧基、醛基、氨基等),因而通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，在外加磁场的作用下,进行快速运动或分离。它的制备方法主要有包埋法、共沉淀法、单体聚合法及化学转化法等方法。Han Lei等采用磁性复合微球作为载体来固定木瓜蛋白酶，实验结果表明,木瓜蛋白酶经过固定化后的活力值、热稳定性及储存稳定性都高于单体酶。而且与单体酶相比，固定化的木瓜蛋白酶表现出了良好的环境适应能力。将木瓜蛋白酶负载到磁性微珠上有多种修饰方式，如王秋雨等通过逐层自组装的方式在自制的经过磺化的聚苯乙烯微球上连接聚电解质和磁性物质制备了核壳结构的磁性微球,并用此磁性微球固定木瓜蛋白酶。吴文兵利用氨基磁性微球固定化木瓜蛋白酶。谢柳等以甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂,聚乙烯醇(PVA)为分散剂,与Fe3O4磁性纳米粒子一起，合成了磁性高分子复合微球(GMAE-DMA)，并以这种微球为载体,进行了对木瓜蛋白酶的固定化研究。由于多巴胺的自聚性及其与镍离子之间的共价结合，我们拟制备Ni-PD-MNPs，用来作为固定化木瓜蛋白酶的载体。

本课题希望通过采用共沉淀法制备Fe3O4磁流体，再通过超声法制备粒径均匀的磁性微粒，最后得到修饰包被的磁性微球Ni-PD-MNPs。将其作为固定化木瓜蛋白酶的载体，研究影响其固定化的不同因素，深入了解固定化酶的性能，达到降解细菌蛋白质从而抗菌的目的，探究蛋白质药物的靶向治疗。

2、研究（设计）的基本内容、拟采用的技术方案及措施

实验的主要内容：

1.共沉淀法制备Fe3O4磁流体。

2.制备多巴胺包被的Fe3O4复合纳米磁性微球。

3.磁性微球固定化木瓜蛋白酶。

4.研究固定化酶的固定化时间，固定化效率，酶活力回收率，固定化酶最适pH、温度，固定化酶重复使用次数，固定化酶稳定性等性质以及其抗菌性。

技术方案：

1. 共沉淀法制备Fe3O4磁流体

称Fe(NH4)2#8226;(SO4)2#8226;6H2O（1.92 g）、FeCl3#8226;6H2O(2.35 g)分别溶于25mL上述除氧的去离子水中，过滤，倒入三口烧瓶中，60℃水浴，加入45 mL 28%的氨水调节pH在11左右，充分混匀，300 r/min搅拌30 min，用去离子水洗6-7次。

2. 制备多巴胺包被的Fe3O4复合纳米磁性微球

取0.3gMNPs分散到200ml10mMTris-HCl（PH=8.5），超声5min，加入0.3g盐酸多巴胺，室温下反应12h。

3. 磁性微球固定化木瓜蛋白酶

将活化后的10mg载体加入一定量的木瓜蛋白酶溶液,室温下摇床振荡,磁分离去上清,以0.1M PBS（pH 7.0）清洗6次,得固定化酶。

4. 研究固定化酶的一些性质

设计不同的变量进行对照实验，如固定化时间和给酶量等。

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