文 献 综 述

1.1 β-半乳糖苷酶

1.1.1 β-半乳糖苷酶简介

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，全名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galacgalacto-hydrolase，EC.3.2.1.23)，简称为乳糖酶。β-半乳糖苷酶来源广泛，主要有：(1) 细菌、霉菌、酵母等微生物；(2) 植物种子，如扁桃籽、杏仁、苹果籽等；(3) 动物内脏或器官[1]。

β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因(LacZ 基因)编码，是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖分解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。从不同物种提取的β-半乳糖苷酶的蛋白质序列有较高的同源性和相似性。β-半乳糖苷酶的分子量介于100~850 kDa之间，其中来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶分子量最大，为520~850 kDa[2]。

表1-1 半乳糖苷酶转糖基反应[5]

1.1.2 β-半乳糖苷酶在糖苷键合成中的应用

β-半乳糖苷酶是使用最为广泛的一种糖苷酶，已有基因工程产品上市。β-半乳糖苷酶除了能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖基的作用[3]。它的热稳定性好，可用于多种糖苷合成。除了合成天然糖苷外，一些非天然醇也被用作转糖基反应的亲核试剂，制备一些非天然糖苷，这些反应的选择性与糖苷配基性质相关[4]。半乳糖苷酶催化的转糖基反应见表1-1。

糖苷酶催化转糖基反应的立体选择性和区域选择性受到许多种因素的影响，如反应温度、有机溶剂、糖苷配基的性质以及受体糖苷的异头碳构型等等[6]。提高转糖基作用立体选择性和区域选择性的一种简便方法是利用受体糖苷的异头碳构型来控制，这项技术被称为异头碳控制法。当甲基-α-葡萄糖苷作为受体，对硝基苯-β-N-乙酰基-D-半乳糖胺作为供体，在β-半乳糖苷酶催化下进行转糖基反应，产物中含有1,4-和1,6-糖苷键的产物比约为5：1，而当采用甲基-β-葡萄糖苷作为受体时，则产生相应的1,3-和1,4-糖苷键的产物比率为4：1[7]。

1.2 核苷类药物糖基化修饰

1.2.1 核苷类药物及二糖核苷简介

核苷类化合物是一类重要的抗肿瘤、抗病毒药物，广泛应用于临床治疗各种癌症。但是，核苷类药物在临床应用中表现出各种毒副作用，并且这类药物口服生物利用度低、在体内不稳定[8]。糖基化修饰是提高其选择性、降低毒副作用的一种有效手段。糖作为信息识别分子，在许多分子识别中起着重要的作用。因此，将糖与核苷相连有望提高核苷类药物的选择性，进而降低其毒副作用，研究表明5-氟尿苷的半乳糖衍生物（5#8217;-O-β-半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母药5-氟尿苷低100倍[9]。并且二糖核苷也是一种重要的抗生素[10]。

1.2.2 二糖核苷合成的研究进展

目前，核苷糖基化衍生物主要通过化学法合成，但由于两底物中均存在多个活性羟基或氨基，化学法的选择性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保护/脱保护步骤，工艺非常复杂[11-14]。而酶法糖基化一般只需一步反应，反应条件温和，具有很高的区域选择性和化学选择性。然而，有关用糖苷酶催化核苷糖基化反应的报道并不多。Binder等[15]利用来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通过转糖基反应催化底物对硝基苯基-β-D-半乳糖苷和四种天然核苷（2#8217;-脱氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率仅为3#8212;7 %，区域选择性很差。Andreotti等[16利用来源于海洋软体动物黑指纹海兔胰腺的β-半乳糖苷酶催化核苷半乳糖基化合成了一系列的二糖核苷衍生物，除5#8217;-O-β-半乳糖基-尿苷的产率达到80 %外，其余目标产物介于12 %#8212;60 %之间。宗敏华等[17]利用商品化牛肝β-半乳糖苷酶，在受体FUdR与糖基供体(oNPG)底物摩尔比为2：1的条件下，合成了FUdR的5#8217;-O-β-半乳糖苷基衍生物，在最适条件下，反应初速率为0.28 mM/h，产率达75 %，5#8217;-区域选择性gt;99%。

1.2.3 二糖核苷合成中存在的问题

尽管生物法催化合成二糖核苷取得了一定的进展，但是仍然存在一定的问题。目前用于合成半乳糖基核苷的糖基供体主要是对硝基苯基-β-D-半乳糖苷，其价格昂贵，限制了二糖核苷的生产与应用。因此，筛选获得一种酶以廉价易得的单糖或者二糖作为糖基供体合成二糖核苷，是一个急需解决的问题。

1.3 本课题研究的目的及意义

本课题拟采用廉价易得的半乳糖或者乳糖作为糖基供体，合成二糖核苷，为二糖核苷的工业化生产扫除成本上的障碍。

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β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因(LacZ 基因)编码，是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖分解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。从不同物种提取的β-半乳糖苷酶的蛋白质序列有较高的同源性和相似性。β-半乳糖苷酶的分子量介于100~850 kDa之间，其中来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶分子量最大，为520~850 kDa[2]。

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