文 献 综 述

一：谷氨酰胺转氨酶的简介：

谷氨酰胺转氨酶是一种催化酰基转移反应的酶，以肽链中的谷氨酰胺残基 γ-酰胺基作为酰基供体，当酰基受体为多肽中赖氨酸残基的 ε-氨基或伯氨基时，它催化蛋白质分子内或分子间的交联、蛋白质、氨基酸、肽链之间的连接；当水为酰基受体时，可催化蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。它能够催化各种蛋白质分子之间或之内发生交联反应，形成 ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸共价异肽键，从而改善蛋白质的结构和功能特性，且经过交联反应，形成分子量较大的物质，较难水解。由于 TGase 具有提高各种蛋白的功能特性的巨大潜能，主要应用于提高蛋白的质地和稳定性，在食品的加工、储藏、保鲜等方面、化妆品、纺织、生物医药等领域具有重要的潜在应用价值。^[1]

二：谷氨酰胺转氨酶的生产菌

TGase 广泛存在于自然界生物中，在动物、植物和微生物（酵母、芽孢杆菌和放线菌等）中都有发现^[2,3]，它是生物体生命活动中一类非常重要的酶。

链霉菌属(Streptomyces spp.)和芽孢杆菌属(Bacillus spp.)是微生物谷氨酰胺转氨酶的(MTG)主要来源。1989 年，日本 Ando 等首次从土壤中筛选出一株可产生TGase 的菌株-Sv.Mobaraense 的变种，命名为 Streptoverticillium S-8112。利用此菌株，味之素公司首先以发酵法生产出 MTG。该的酶分子质量是 37.9 kD，球状构型，单聚链，含有 331 个氨基酸，活性中心含有一个自由硫巯基的 Cys 残基，有亲水性，且活性不依赖 Ca2 。微生物来源的 TGase 属于胞外酶，合成的酶可直接分泌到培养基中，经离心后就可得到粗酶液，因此，其后续的分离、纯化步骤相对于动植物来源的 TGase 的分离、纯化要更加容易些、方便些，且微生物来源广泛，发酵产酶周期短，可进行大规模工业化生产。此外，MTG 对热和 pH 稳定性高，便于储存。近年来，微生物来源的 TGase 已初步成为商业化生产的主要酶来源。

三：谷氨酰胺转氨酶生产菌的发酵条件

由于 MTG 巨大的经济效益，国内外众多学者纷纷进行研究，以获得具有自主知识产权的优良菌株^[9,10,11]。要解决这一问题，可以从几个方面考虑。一方面，为了提高 MTG 的产率，研究者们不断筛选产谷氨酰胺转氨酶的的各种微生物，同时对发酵培养条件及培养基成分进行不断的改良。1996 年，通过采用黑箱模型的方法，Zhu Y 等^[4]对 Streptoverticillium 的产酶培养基进行优化设计，最终得到优化后的培养基为：Peptone 2.0 %、Starch 2.0 %、K₂HPO₄0.2 %、KH₂PO₄0.2 %、MgSO₄0.2 %、Yeast extract 0.2 %、PPG 0.05 %、Arg

0.03 %、Asp 0.0649 %、Asn 0.0155 %、Cys0.0023 %、Gly 0.0145 %、His 0.0063 %、Ile 0.0083 %、Met 0.0092 %、pH7.0,30 ℃培养3d，最终酶活0.9 U/mL。1997年，Junqua

^[5]等以Streptoverticlliuim cninmanouem为出发菌株，通过实验设计方法优化培养基，得出当甘油为 3.12 %，酪蛋白 3.84 %时，MTG 最高酶活达 0.33 U/mL。2002 年杨立刚、江波等^[7]以 StreptoverticillimuSK-1 为出发菌株，对摇瓶发酵条件进行优化，结果显示：当主要氮源玉米浆为 50g/L，起始 pH 值为 7.0-7.5，培养温度为 30 ℃，接种量范围为 5 %-10 %，培养时间为 38 h 时，酶活最高可达 4.52 U/mL。2008 年，杨雪霞等^[8]通过正交试验确定发酵培养基为：豆饼粉 20 g/L、硫酸铵 3 g/L、甘油 20 g/L、酵母膏 6 g/L、MgSO₄#183;7H₂O2 g/L、K₂HPO₄#183;3H₂O 2 g/L，经过培养基优化后，酶产量提高到 7.45 U/mL。

四：菌种的培养与发酵^[12]

1：温度对TG酶生产菌的影响

培养温度对微生物的生长具有很大影响。它主要是通过影响微生物体内酶的合成和活性，进而影响微生物的生命活动^[13]。在本实验中，我们采用两阶段培养法来确定生产菌的最适生长温度和酶蛋白表达温度，分别在不同温度下培养发酵后比较各个温度条件下生物量和发酵液中酶活，选出最适宜的温度。

2：PH值对TG酶生产菌的影响

pH 对微生物的生命活动有很大的影响，直接影响着生物量及产物的合成量。pH 值的改变可以影响酶的活性，改变细胞对营养物质的利用率，同时也会产生有害物质从而抑制菌体的生长^[13，14]。用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 将发酵培养基初始 pH 分别调到不同PH值进行发酵，分析不同初始pH 值对目的蛋白表达的影响，选出最适宜的PH值。

3：溶氧对TG酶生产菌的影响

谷氨酰胺转氨酶生产菌的发酵属于好氧发酵，氧的供给非常重要，因此培养基中需要保持充足的溶氧以保证菌体的呼气及产物的合成^[16,17]。在摇瓶发酵过程中，摇瓶装液量的大小和摇床的转速可以体现溶氧水平的高低。

4：培养基的优化

1）碳源、氮源的确定

碳源、氮源是生物体生长的必需物质，它对微生物生长代谢具有重要作用，为细胞生命活动提供所需的能量和碳架。选取不同的碳源和氮源种类及浓度进行发酵，测定发酵曲线，确定最适碳源、氮源种类及最佳碳氮比。

2）无机盐的选择

微生物在生长繁殖和合成目标产物的过程中，需要某些无机盐作为其生物活性物质的组成或代谢的调节物。其中，在物质组成方面，磷是核酸、蛋白质 ATP等重要细胞物质的组成部分，在代谢调节方面，磷有利于糖代谢的进行，为细胞的生长提供能量；钠、钾等离子虽不参与细胞的组成，但是微生物发酵培养基中的必要成分。钠、钾离子都参与维持细胞的渗透压，且钾离子还是许多酶的激活剂，它能促进糖代谢。镁是许多重要酶(如己糖磷酸化酶、羧化酶)的激活剂，可影响基质的氧化和蛋白质的合成。镁常以硫酸镁的形式加入培养基中，其中的硫可构成细胞物质，因此在培养基中需加入适量的硫化合物以满足产物的合成。

3）微量元素对菌体生长的影响

虽然微量元素极微量的存在于微生物体内，但会强烈的刺激微生物的生长繁殖。

4)发酵方式的不同的影响

谷氨酰胺转胺酶生产菌的发酵属于高密度发酵，较高的种液菌体浓度对发酵产酶有着很大的影响，而种液菌体浓度及发酵产酶量都与发酵培养条件的选择(如营养物质、溶氧、温度、pH 等)、培养方式、补料方式、生长因子等有关。

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