1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

碳源的高效利用是微生物制造生物基产品的关键，而细菌中心碳代谢在转录水平的精细调控成为了近年来的研究热点，特别是一些兼性厌氧菌在好氧和厌氧代谢途径之间的转录调节被广泛的研究，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，分别作为革兰氏阴性菌和低GC的革兰氏阳性菌的代表，已对其碳代谢的转录调控机制做了大量的研究[1]，在这些细菌中，参与碳代谢的基因通过多个转录调控因子的复杂调控，表明其对转录调控网络中的相关基因的协调表达有着重要的作用。

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）长期被认为是一种好氧微生物，可以在简单无机培养基中生长良好，并在氨基酸（如谷氨酸、赖氨酸等）的大规模产业化中有着悠久的研究历史。2004年，Inui等人发现谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下虽生长停滞，但可以具备基本的代谢能力生产乳酸和丁二酸[2]，并对谷氨酸棒杆菌进行了改造，去除了副产物乳酸，过量表达丙酮酸羧化酶，增强固定CO₂的羧化回补途径[3]；建立了有氧产菌、厌氧产酸的两阶段发酵策略。在厌氧条件下，他们以碳酸氢钠为CO₂供体，批量添加葡萄糖生产丁二酸，丁二酸产量最终达到146 g/L，产酸速率达到3.2g/L每小时，这是迄今为止文献报道的最高丁二酸发酵产量。但是与其他丁二酸生产菌相比，谷氨酸棒杆菌的单位生物量产酸速率并不高，只有64(mg gDCW^#8722;1 h^#8722;1)[4]。作为重新定义的兼性厌氧的高GC革兰氏阳性菌，谷氨酸棒杆菌碳代谢的转录调控机制就有着重要的研究意义。最近的研究发现，一些谷氨酸棒杆菌中的转录因子SugR、RamB、RamA、GlxR等也被发现参与其碳代谢多个基因的表达，且调控机制明显不同于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌[5]。基于谷氨酸棒杆菌厌氧条件下生产有机酸的应用潜力，对其相关转录调控机制的研究具有重要意义。

表1. C. glutamicum ATCC 13032从葡萄糖合成丁二酸途径中关键基因的调节基因

（根据CoryneRegNet 6.0 [6]信息整理）

Fig. 1. Genes involved in sugar uptake, glycolysis, the tricarboxylic acid cycle, lactate metabolism, acetate metabolism, and ethanol metabolism. Representative genes or operons characterized as regulon of SugR, RamB and RamA are boxed, and negative (minus signs) and positive (plus signs) transcriptional regulation are indicated in parentheses.

课题组在前期研究中从C. glutamicum ATCC 13032（Wild-type strain）和1006（auxotrophic for arginine）出发，构建了谷氨酸棒杆菌的发酵产丁二酸菌种SA001（In-frame deletion of the ldh gene of ATCC 13032）和#7（In-frame deletion of the argG gene and ldh gene of 1006），并建立了从有氧转厌氧的连续发酵过程。以丁二酸工业化生产为研究目标，采用了低生物量的策略。在有氧阶段培养12小时菌体后，菌体达10.0 gDCW/L后，转入厌氧，以碳酸氢钠为CO₂供体，每12小时添加30克葡萄糖，82小时后丁二酸的产量最高可达80 g/L。在厌氧产酸过程中，菌体量并无明显下降。除产物丁二酸外，主要副产物为乙酸，其它物质为痕量，这与Shohei等人的结果一致[3]。实验结果中，平均糖耗速率和产酸速率要显著低于Shohei等人的工作，这显然是由于生物量低的缘故；而菌种单位生物量产酸速率为99 (mg gDCW^#8722;1 h^#8722;1)，要高于Shohei等人的结果，但是比多数文献报道的产丁二酸放线菌或大肠杆菌工程菌要低[7]。在我们的实验结果中，还观察了糖耗速率和产酸速率与乙酸量的密切相关。随着发酵液中乙酸浓度的增加，糖耗速率从起始12小时的2.45 g/L#183;h，下降到最后12小时的1.39 g/L#183;h，下降了43%；产酸速率也是相似的情况，下降了41%。这表明发酵液中乙酸浓度显著抑制糖耗速率和产酸速率。这种现象也普遍存在于其他微生物发酵过程，如大肠杆菌高密度发酵。如果在有乙酸存在时，能保持菌种的初始阶段糖耗速率和产酸速率，将可以获得理想的丁二酸产量。

在谷氨酸棒杆菌厌氧发酵体系中，主要存在葡萄糖、碳酸氢钠、丁二酸和乙酸。葡萄糖浓度对谷氨酸棒杆菌的葡萄糖利用不是限制因素，低碳酸氢钠浓度影响产丁二酸速率，较高浓度有利于丁二酸的生产，谷氨酸棒杆菌也可以耐受高浓度的丁二酸，因此乙酸的量是影响糖代谢速率和丁二酸产生速率的主要因素[3]。而在此乙酸的产生负责提供NADH，给经羧化回补途径产生丁二酸之用[4]，通过基因敲除的方法，减少乙酸，将会影响丁二酸的产量。最近，Boris Litsanov等人通过阻断乙酸和乳酸生成途径(Δcat, Δpqo, Δpta-ackA, ΔldhA)，整合表达丙酮酸羧化酶基因pyc^P458S，表达来源于Mycobacterium vaccae的甲酸脱氢酶(FDH)提供还原力，使丁二酸产率达到1.59 mmol g (cdw)^#8722;1 h^#8722;1，产量为1.67 mol/mol葡萄糖[8]，但该过程需要额外添加甲酸，一定程度上增加了生产成本。如何在有乙酸的情况下，保持糖代谢和产酸速率将成为关键。

SugR是一种近来发现的、在谷氨酸棒杆菌中起重要作用的、调控糖代谢的转录因子[9]。作为转录阻遏蛋白，SugR结合于糖磷酸转运系统（PTS）基因簇、多个糖酵解相关基因的启动子区域，控制着这些基因的表达[10, 11]。这些基因包括通用的PTS基因ptsI和ptsH、特异转运葡萄糖的ptsG、特异转运果糖的ptsF、特异转运蔗糖的ptsS、甘油-3-磷酸脱氢酶基因gapA、磷酸果糖激酶基因pfkA、果糖二磷酸醛缩酶基因fba、烯醇化酶基因eno、丙酮酸激酶基因pyk，以及NAD依赖的乳酸脱氢酶基因，见图1。这些基因都和PTS糖的代谢密切相关。研究表明，过表达SugR将导致上述基因的表达下降，糖代谢速率变慢，生长减缓[12, 13]。

与野生型相比，缺失sugR基因的菌种葡萄糖为唯一碳源培养的条件下，上述基因的表达并无显著变化，但在添加乙酸的培养条件下，上述基因的表达增强[12-14]，糖代谢加快，生物量增加[15]。Blombach等发现丙酮酸脱氢酶复合体缺陷的谷氨酸棒状杆菌在生长期，敲除sugR基因和用乙醇替代乙酸，都可以有效提高缬氨酸的产量[16]。这些表明野生菌在有氧条件下培养时，乙酸的存在有激活SugR阻遏的作用，而在sugR缺失的菌种中，乙酸不存在这种作用。Engels等报道，在厌氧情况下，过表达SugR，可以降低乳酸脱氢酶的活性，使乳酸产量减少25%，敲除sugR基因后，乳酸脱氢酶活性较提高7倍，乳酸产量增加3倍[12]。这说明在厌氧条件下，野生菌的SugR有阻遏作用存在，敲除sugR有利于被阻遏基因的表达。根据上述实验结果，我们认为sugR在谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的过程中，也会对受其调控糖代谢相关基因起阻遏作用，特别是当存在发酵副产物乙酸时。敲除sugR将有利于糖代谢相关基因的表达，在厌氧产酸、当乙酸积累时，可以解除乙酸对糖代谢的抑制作用。目前并无相关的研究报道。

在Engels等考查谷氨酸棒杆菌sugR缺失对其厌氧情况下产乳酸的影响研究中，采用了LB完全培养基（含4%葡萄糖）好氧发酵16小时，CGXII（以葡萄糖为唯一碳源）培养基[17]并添加硝酸盐所为电子受体厌氧发酵的策略[12]。该过程不同于实验室现有利用谷氨酸棒杆菌产丁二酸的好氧厌氧两阶段策略，以完全培养基进行好氧培养和以葡萄糖为唯一碳源培养基进行好氧培养可能存在中心碳代谢部分关键酶表达调控的差异，进而可能对厌氧条件下有机酸生物合成产生影响。如已有的对于gapA基因编码的甘油-3-磷酸脱氢酶的研究就发现，在以葡萄糖为唯一碳源的情况下，sugR缺失对gapA转录水平的影响最小，在以果糖或蔗糖为碳源时影响较明显，而对sugR与gapA-pgk-tpi操纵子结合位点的突变会对该基因启动子有明显影响[18]，再加上gapA还受glxR（谷氨酸棒杆菌中类似于大肠杆菌中cAMP受体蛋白的全局转录因子）等的调控，说明sugR对于一些基因的转录调控是间接的，且根据碳源的不同，调控机制不同。此外，有研究发现谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下由于呼吸链上硝酸盐还原酶的作用可以利用硝酸盐生长[19]，硝酸盐的添加对谷氨酸棒杆菌厌氧过程的代谢机制可能会造成影响，已发现glxR结合在硝酸盐还原酶narKGHJI操纵子和乳酸脱氢酶ldhA的启动子区域[20]，无论好氧还是厌氧条件下都激活的表达[21]，而对于sugR是否存在对硝酸盐还原酶的调控目前无相关报道。

为了验证谷氨酸棒杆菌sugR缺失菌株生长过程与机制的一致性，并为后续解决如何在有乙酸的情况下保持谷氨酸棒杆菌糖代谢和产酸速率提供新的解决方案，本课题根据文献，结合实验室现有谷氨酸棒杆菌产丁二酸培养条件，先考查谷氨酸棒杆菌sugR缺失菌株的培养条件，如好氧厌氧两阶段发酵时间、培养基碳源、厌氧条件硝酸盐添加等因素的影响，进而考查sugR缺失对糖代谢相关基因表达的影响，对糖代谢速率和产丁二酸速率的影响，以及乙酸浓度对sugR功能的影响。

主要参考文献：

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1 本课题要研究或解决的问题

（1）研究谷氨酸棒杆菌sugr基因缺陷菌株生长特性，确定好氧厌氧两阶段发酵基本条件，初步考查好氧阶段碳源（完全培养基或以葡萄糖为唯一碳源）差异对厌氧阶段有机酸生物合成的影响。

（2）研究谷氨酸棒杆菌厌氧条件下，sugr基因缺陷，在转录、翻译和代谢各层面，对突变菌种的影响；研究sugr基因缺陷对糖代谢速率、丁二酸生产速率的影响。阐明sugr在厌氧下，对谷氨酸棒状杆菌糖转运系统和糖酵解途径的调控方式。