1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1．裂殖壶菌概述

1.1裂殖壶菌简介

裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门（Eumycota）、卵菌纲（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、破囊壶菌科（Thraustochytriaceae）的一类类藻的海洋真菌，单细胞、球形。目前已分离了五个种，分别是：S.aggregatum、S.octosporum、S.mangrovei和S.limacinum。裂殖壶菌细胞积累大量对人体有用的活性物质，如：油脂、色素（类胡萝卜素、叶黄素、虾青素等）、角鲨烯[1]等，其中油脂占细胞干重的70%以上，总脂肪酸中DHA的含量高达35%-45%，且细胞中90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂-甘油三酯（TG）形式存在，还有的是以卵磷脂（PC）形式存在，如1-棕榈-2-DHA-PC[2]。

1.2 裂殖壶菌研究水平概述

1.2.1国内外研究概况

随着水产养殖业的迅速发展和DHA在食品、药品等行业的应用，人们对DHA的需求将不断扩大，因此通过裂殖壶菌发酵产DHA具有深远意义和重大市场应用价值。 国内外对裂殖壶菌的研究主要集中在菌种的诱变和筛选，发酵条件的优化[3-7]，如碳源、氮源、碳氮比、无机盐、前体促进物质以及溶氧、PH等方面的研究。近年来，随着对DHA合成机理进一步地认识，研究者开始对合成DHA的代谢调控进行研究，并已经取得初步进展。

1.2.2 裂殖壶菌合成DHA的代谢机理

长链脂肪酸的合成是碳链延伸和耗能的过程，需要原料物质乙酰CoA、不同种类的酶和NADPH提供能量。乙酰CoA来源糖酵解、脂肪酸β-氧化和磷酸戊糖途等，但乙酰CoA不能透过线粒体膜，必须通过一种运送机制才能从线粒体内进入细胞质。在线粒体内，乙酰CoA和草酰乙酸缩合形成柠檬酸，通过柠檬酸和苹果酸易位酶的作用, 柠檬酸可以通过线粒体膜，在细胞质内，被ATP-柠檬酸裂解酶降解为乙酰CoA和草酰乙酸，草酸乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下，产生NADPH提供脂肪酸合成过程中所需的还原力，产生的乙酰CoA作为脂肪酸合成的起始物（图1-2）。

图1-2 乙酰CoA、NADPH生成途径

在乙酰CoA和NADPH充足供应的基础上，微生物细胞内长链多不饱和脂肪酸的合成主要有两条途径，一条是有氧途径[8]（图1-3），在氧分子、NADH和NADPH存在的条件下通过饱和脂肪酸的延长和去饱和过程进行，广泛存在于浮游生物、真菌、藻类、某些细菌和哺乳动物中。另一条是厌氧途径，双键先在中等链长度的脂肪酸上形成，然后进行链的延长反应，一般存在于少部分细菌和真菌中。DHA作为长链不饱和脂肪酸，在一些微生物体内也有着特殊的合成途径，如在Schizochytrium sp.等一些生物体内DHA亦可以通过PKS路径合成[9]（图1-4）。

图1-4 DHA的生物合成PKS途径

1.2.3 裂殖壶菌生理性状研究概况

对于裂殖壶菌的胞内小分子物质的研究已初步展开。裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512是高产二十二碳烯酸的海洋真菌，其细胞内油脂占细胞干质量的18.3%。细胞油脂的总脂肪酸组成为45.7%DHA，12.5%DPA和41.8%棕榈酸。薄层色谱分析表明裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512的细胞油脂组分以中性的甘油三酯为主，其次是极性脂类，主要有游离脂肪酸、1,3-甘油二酯和单甘油酯，其中26.4%极性脂和73.6%中性脂。气相色谱分析表明，在极性脂中DHA的质量分数高达76.1%显著高于中性脂中的DHA质量分数（34.8%）[10]。

对裂殖壶菌整体的生理性状研究还很少。已有研究对两种不同氮源条件下裂殖壶菌的营养成分进行分析，结果表明：裂殖壶菌菌体中主要为蛋白质和脂类。而且，裂殖壶菌的生化组分与培养条件直接相关，不同氮源条件下生长的裂殖壶菌其生化组分明显不同。在氮源为大豆水解物的条件下培养的裂殖壶菌其细胞内主要成分是脂类，含量达42.83%，蛋白含量较低，为9.35%；而以酵母提取物为氮源培养的裂殖壶菌细胞中蛋白含量高达42.51%，而脂类含量相对较低。两种氮源条件下培养的裂殖壶菌蛋白质中氨基酸的组成相同，但相对含量差别明显[11]

2．营养限制对产油微生物生理性状的影响

对于DHA此类具有高附加值的长链多不饱和脂肪酸产品，要想实现其规模化 生产，必须向高产量、高产率、低成本方向发展。脂肪酸为胞内代谢产物，获得高的细胞密度是高产量的前提，因此，如何解决微生物细胞的生长问题是研发的首要任务，其次，微生物的产油过程往往和生长存在一定的矛盾，据报道，产油微生物只有在培养环境中出现一定的营养刺激条件时才能激发其产油途径中的一系列酶作用，从而大量积累油脂。

2.1 氮、磷、硫和碳等营养限制条件

在诸多影响微藻生长和油脂积累的非生物因素中,氮源的影响最为明显,通常情况下，氮缺乏有利于微藻油脂的积累，但不利于微藻的生长。氮源充足可以促进微藻的生长, 但会抑制其微藻油脂的积累,以海南本地分离的微芒藻（Micractinium pusillum）Y-002为例，在营养限制条件下，油脂积累产生了很大的变化，在整个研究过程中，藻株继代培养时都生长在TAP 固体平板上,而测定时分别接种于含50 mL 液体培养基及相应的营养缺陷培养基中。通过对其微藻干重、总蛋白、总糖和油脂的获取及比对，结果表明：氮源缺乏时油脂积累表现最为明显，其次是硫元素缺乏[12]。除氮源限制之外的另一种促进微生物产油的有效手段，目前也成功应用在Rhodotorula glutinis[13]中。从海南本地水域分离得到一株高含油藻，鉴定其为Chorella sp KMMCC FC-21。将其培养在高碳培养基和低碳培养基和SE以及他们相应氮元素、硫元素和磷元素缺乏的培养基中，研究上述三种元素缺乏对其生物量和油脂积累的影响。结果表明：氮元素和硫元素缺乏使其生物量大幅度减少，但却能促进油脂的积累，在高碳作用下更明显，而磷元素的缺乏只能小幅度增加含油量，在高碳培养基、高碳缺氮培养基、高碳缺磷培养基、高碳缺硫培养基中细胞组分分析表明：氮元素、硫元素和磷元素缺乏促进胞内油脂积累的同时却使总糖和总蛋白的含量减少[14]。另有研究表明，根据异样小球藻在不同的碳氮比下细胞内之类含量和脂肪酸组成进行了研究，发现碳限制或氮限制均能促进细胞内脂肪合成。但前者更为明显，因为较低的碳源的供应使不饱和脂肪酸，特别是三烯酸的的比例增加了[15]。

2.2 营养条件限制促进产油的机理

众多研究认为，氮缺乏会导致微藻油脂的积累。核蛋白小球藻（Chlorella pyrenoidosa）[16]和隐甲藻（Crypthecodinium cohnii)[17]在氮元素缺乏时油脂含量增加。这可能是因为元素缺乏对微藻来说是一种环境胁迫，它刺激微藻启动了抗逆生理反应，即通过过量积累油脂来渡过不利环境。元素缺乏在高碳情况下，微藻通过吸收培养基中的乙酸钠作为碳源，经乙醛途径生成乙酰辅酶A，为油脂合成提供原料。细胞组分测定结果表明，在氮缺乏和硫缺乏培养基中，当藻类细胞开始积累油脂的同时，细胞内总糖和总蛋白的含量则下降，N和S是蛋白质的主要组分，二者的缺乏会使细胞内蛋白质的合成受到影响，因而碳流向会更多地向油脂合成倾斜。

3 本研究的意义

本研究以裂殖壶菌为研究对象，针对DHA发酵过程中生产效率低，发酵过程控制难这一产业化问题，引入代谢组学和脂质组学技术，从胞内小分子代谢物层面、组成细胞的大分子物质层面以及最终产品的脂质物质层面，探究裂殖壶菌发酵过程中的微观代谢信息，丰富对DHA代谢机理的认识；并结合细胞在不同环境应激条件下的微观信息的响应机制，获得与DHA产量和最终油品质量相关的关键物质，从微观小分子层面对发酵过程进行调控，以提高DHA的生产效率和产品质量，降低成本，提高国内DHA油脂产品的国际竞争力。本研究为实现从生理生化角度全方位剖析细胞代谢机制提供指导。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

解决的问题：

本课题拟对裂殖壶菌在氮源、磷源进行单营养限制条件下的发酵培养过程中分别从裂殖壶菌的胞内代谢物、大分子及油脂组分等方面研究其在不同营养条件下生理性状的变化，找出裂殖壶菌生长及产油的生物标志物，对发酵做出指导。

研究手段：