1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，以下简称ε-PL）是日本的酒井平一和岛昭二^[1]两位博士1977年在大量筛选有价值的生物碱（Dragendorff-positive）物质时首次发现的一种新型聚合物。ε-PL具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，且具有安全性能高、水溶性好、热稳定性好等优点，是一种性能优良的生物防腐剂。此外，ε-PL在化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料等领域也具有广阔的开发和应用前景。目前世界上仅有日本实现了ε-PL工业化^[2]，ε-PL市场价格居高不下，限制它的广泛应用。总之，ε-PL作为一种具有巨大的应用潜力与商业价值的生物高分子，已成为众多学者的研究热点。

本实验室在研究ε-聚赖氨酸时，在聚赖氨酸生产菌株的发酵液中首次发现一种新型聚氨基酸：β-聚二氨基丙酸（β-Poly -L-diaminopropionic acid，以下简称β-PDAP），它是由L-二氨基丙酸的β-氨基与另一L-二氨基丙酸的α-羧基形成的β-酰胺键连接而成。目前关于该物质的性质了解较少，本实验室正在进行相关研究。

ε-PL的结构式 β-PDAP的结构式

1. 聚赖氨酸的相关信息

1.1 聚赖氨酸的理化性质

ε-PL是一种由微生物大量生产的氨基酸同型聚合物，它由人体必需氨基酸L-赖氨酸的ε-氨基与另一L-赖氨酸的α-羧基形成的ε-酰胺键连接而成^[3]。ε-PL纯品为淡黄色或白色粉末、吸湿性强，略有苦味；极易溶于水、盐酸，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，有良好的热稳定性，在100 ordm;C加热处理30 min及120 ℃加热处理20 min，均保持其抑菌能力。ε-PL的等电点pI约为9.0，比旋光度[α]²⁵_D为 57.1#176;（c=1，H₂O），[α]²⁵_D 为 39.9#176;（c=1，5mol L^-1 HCl），熔点Mp为25 ordm;C ^[4]。

1.2 聚赖氨酸的生理功能和临床应用

ε-PL具有水溶性、聚阳离子、无毒可食用、可生物降解等许多独特的理化和生物学特性，这些特性使其具有抗菌抗病毒、安全、耐高温等优点。因此，在注重安全、环保的今天，ε-PL及其衍生物在食品、医药、农业、电子等诸多领域将具有十分广阔的应用前景。

ε-PL及其衍生物的应用

1.3 聚赖氨酸生产菌株

高效生产菌株的选育是ε-PL研究的热点之一。日前工业上一般采用S. albulus作为ε-PL的发酵生产菌株，它是1981年由Shima S和Sakai H^[4]筛选得到并进行分类鉴定的。

在很长一段时间内，筛选ε-PL的产生菌都是一项繁琐的工作。直到2002年，日本学者Masanobu^[5]找到了一种颇为有效的ε-PL菌株筛选方法，通过在培养基中加入一种酸性染料PolyR-478，可以在ε-PL产生菌的菌落周围看到明显的颜色变化，克服了ε-PL生产菌株筛选的盲目性，可以进行大规模的筛选。Masanobu采用这种方法，对各地土壤样品进行了大规模的筛选，获得了多株ε-PL产生菌株，并且发现这些菌株大部分属于链霉菌。在链霉菌中，除了白色链霉菌外，北里孢菌、诺氏链霉菌和弗吉尼亚链霉菌也具有产ε-PL能力。Epichloe sp.MN-9是日前发现的唯一一株产ε-PL的真核微生物菌株。

1.4 ε-PL发酵生产工艺概况

ε-PL发酵生产的影响因素很多，包括菌株、培养基、培养条件等，均与ε-PL的生产密切相关。

自然界筛选得到的ε-PL生产菌株其产量普遍很低（摇瓶产量低于2 g L^-1），所以具有实际生产价值并能够用于工业生产的菌株均经过诱变选育得到。1988年チッソ株式会社的平木纯和森田裕以S. albulus 346菌株为出发菌株，经过N-甲基-N-硝基-N^#8217;-硝基胍（N-methyl-N-nitro-N^#8217;-nitrosoguanidine，NTG）作用后，以L-赖氨酸的结构类似物S-AEC为筛选标记，筛选得到编号为11011A-1号的突变菌株，其摇瓶发酵产量比出发菌株提高3.3倍；此外还以100 mg L^-1的氯霉素作用于S. albulus 346菌株并培养8 h，筛选得到质粒扩大菌株编号为50833菌株，其摇瓶发酵产量比出发菌株提高9倍^[6]。1997年チッソ株式会社的岩田敏治和平木纯等^[7]以S. albulus 11011A-1为出发菌株，经过NTG、紫外线照射、5-溴尿嘧啶等试剂处理后，以10 mg mL^-1的S-AEC作为抗性标记，筛选得到编号为B21021的S-AEC高浓度抗性菌株。2001年Kahar等^[8]以S-AEC和Gly为抗性标记，以S. albulus 346菌株为出发菌株，筛选得到具有AEC^r和Gly^r的菌株编号为S. albulus 410，其摇瓶产量提高6倍。

ε-PL生产工艺优化对于ε-PL的影响也很大。由于ε-PL产生菌株的摇瓶批式发酵产量低下，均在0.2~10 g L^-1。为此，平木纯等人采用发酵罐批式发酵，并采用调控pH等条件来提高ε-PL产率。1997年，チッソ株式会社的岩田敏治和平木纯等^[7]以B21021菌株为研究对象，3 L发酵罐中采用10%氨水调控体系pH4.0，补加葡萄糖和硫酸铵，发酵培养72 h时ε-PL产率为16.2 g L^-1，而发酵培养168 h时ε-PL产率为31 g L^-1，产率有了较大幅度的提高。2001年Kahar 等人研究了S. albulus 410菌株在5 L发酵罐中调控发酵，结果发现在搅拌转速为350 r min^-1，通气量为1 vvm下，采用氨水调控体系pH值，在发酵前期调控体系pH5.0，以促进菌体增长；在发酵中后期调控体系pH4.0，补加葡萄糖和硫酸铵，在补加葡萄糖时，葡萄糖浓度控制在10 g L^-1左右，发酵培养8天后，ε-PL产率高达48.3 g L^-1，较没有采取调控时，产率提高10倍之多^[8]。此外，由于白色链霉菌在发酵过程中形成菌丝球，搅拌转速的提高，产生巨大的剪切力，容易将菌丝球剪切成丝状，增加了细胞内核苷酸等相关物质渗入到发酵液中，不利于产物的提取，并且提高搅拌转速，需要消耗大量的动力，增加了工业化成本。2002年Kahar等^[9]采用气升式发酵罐生产ε-PL，在动力消耗为0.3 kw m^-3下，ε-PL产率可达30 g L^-1，而在搅拌罐中生产相同产量的ε-PL则需要消耗8 kw m^-3，由此表明，采用气升式发酵罐生产ε-PL可以更有效地降低生产成本。

1.5 ε-PL的应用实践

目前，ε-PL主要作为食品防腐剂而应用在食品工业中。ε-PL已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂（FDA批准号：GRN 000135）。此外，ε-PL在保健食品，医药领域，高吸水性树脂制备及生物领域中均有着广泛的应用前景。

1.5.1.ε-PL在食品防腐领域中的应用

食品的腐败变质主要是指由于微生物的作用而导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化。全世界每年约有10~20%的农副产品、水产品、果蔬因为腐败变质而无法食用，经济损失巨大，而且腐败变质食品对人类的健康卫生造成巨大威胁^[10]。开发抗菌性强、安全无毒的天然防腐剂已成为各国食品科技工作者的研究重点。其中，ε-PL作为新型的食品保鲜防腐剂具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH范围广等优点，具有巨大的商业潜力，受到人们广泛的关注。

1.5.2.ε-PL作为食疗剂在保健食品中的应用

ε-PL在食疗方面的应用具有广泛的应用前景。肥胖是一种严重的疾病，它会导致许多健康问题如糖尿病、高血压、动脉硬化等。预防肥胖的首要手段就是低脂肪饮食；另一种可行的手段是摄取天然产物以限制肠内脂肪。众所周知，胰脂肪酶在脂类吸收中起到至关重要的作用，因此使用天然产物降低胰脂肪酶的作用可减少肠内脂肪吸收。最近，Kito等^[11]首次报道了ε-PL抑制脂肪酶活力特征及ε-PL对饭后甘油三脂的抑制作用，指出ε-PL能够浓度在10~1000 mg L^-1时作用于含有胆盐和磷酸胆碱的乳剂并使其分解，从而抑制脂肪酶活性。

1.5.3.ε-PL在医药领域中的应用

ε-PL在医药方面主要应用于药物的缓释和靶向载体。由于ε-PL富含阳离子，与带有阴离子的物质有很强的静电作用力并很容易通过生物膜，这样可以降低药物的阻力并提高药物的转运效率。可将ε-PL用作某些药物的载体，这在医疗和制药方面得到广泛的应用^[12-14]。Szende等人^[15]发现ε-PL能够抗人体血红白血病细胞（K-5620）和老鼠淋巴白血病肿瘤细胞（L1210）Gugerli等人^[16]将Mw为2500~20500 Da的蛋白质包埋于PL-海藻酸盐的膜内，成功的实现了蛋白质在膜中的缓释。Fan-Tsl等将PL作为媒介应用与酶联免疫检测（ELISA）。Fan用PL包裹T₂毒素，然后接种白兔T₂抗体，通过专一性的抗原抗体反应来检测抗体的数量^[17-19]。此外，由于ε-PL是阳离子型高聚合物，并且有很强的抗菌性和抗病毒能力，因此有望开发成抗菌纤维。

1.5.4.ε-PL在吸水树脂中的应用

ε-PL通过简单的辐射交联可得到高吸水性树脂。日本物质工学工业技术研究所的Choi等^[20]用γ-射线使ε-PL交联得到吸水倍数约200倍的高吸水性树脂SAP，另外Kunioka等^[21]把ε-PL和γ- PGA用γ-射线交联得到吸水倍数约为150倍的树脂。ε-PL交联得到的吸水性树脂的吸水性比聚丙烯酸和聚谷氨酸交联得到的树脂低，但有研究表明ε-PL树脂在盐溶液中的吸水倍数比市售的聚丙烯酸和γ-PGA的树脂高许多。将ε-PL吸水性树脂与土壤结合，不仅可以改进团粒，还能改进土壤的保墒、保湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠方面发挥积极作用。

2. 聚二氨基丙酸的相关信息

聚二氨基丙酸（PDAP）是一种由白色链霉菌（Streptomyces albulus PD-1）产生的的氨基酸同型聚合物，它是由L-二氨基丙酸的氨基与另一L-二氨基丙酸的羧基形成的酰胺键连接而成。PDAP纯品为淡黄色粉末、吸湿性强，极易溶于水、盐酸。PDAP的聚合度分布在5-15之间，对应的分子量约为500-1500。PDAP是一种新型聚氨基酸，目前尚未有相关报道，系本实验室首次发现。其单体shy;二氨基丙酸是一种从植物中提取的氨基酸，早在1945年就发现它可以有效抑制白喉棒状杆菌的生长^[22]。近年来shy;二氨基丙酸因为它的结构特殊重新引起了化学和药学工作者极大的兴趣。首先是它的邻二氨基结构，这是一种在植物中广泛存在的一种结构单元。例如在我国传统中药三七中存在的止血活性成分三七素^[23]以及在山黧豆中发现的一种使人或动物中毒的神经毒素^[24]，都是 这种邻二氨基结构的化合物。其次，它还是很多抗菌肽的氨基酸组分，象伊短菌素(edeine)^[25]、结核放线菌素(tuberactinomycin)^[26]以及临床上用途非常广泛的博莱霉素(bleomycin)^[27]等。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

一：在摇瓶水平研究聚赖氨酸和聚二氨基丙酸联产的规律，找出影响两种聚氨基酸联产的因素

二：初步研究5l发酵罐上聚赖氨酸和聚二氨基丙酸联产规律，目的是抑制聚二氨基丙酸的合成，增加主产物聚赖氨酸的产量。