1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述

1.木糖醇的性质和应用

1.1木糖醇的物化性质

木糖醇（Xylitol），又称戊五醇、五碳多元糖醇，是一种无味的白色结晶或结晶体粉末状物质，分子式C_5shy;H₁₂O₅，分子结构式如图1-1所示。其相对分子质量为152.15，熔点92-96℃，具有吸湿性，甜度相当于蔗糖，入口后清凉，口感好，没有杂味；热量低（2.4cal/g），它的溶解度、溶液密度等理化指标与蔗糖基本相同^[1]（表1），是蔗糖的理想替代品。木糖醇于20世纪70年代被国际粮农和卫生组织食品添加剂法规专家委员会(JECFA)批准为A类食品添加剂^[2]，并对其ADI值不作规定^[3]。国际食品法典委员会(CAC)于1999 年6月批准木糖醇为”在食品中可以按正常生产需要使用的食品添加剂” ^[4]。

图1-1 木糖醇分子结构式

Fig.1-1 Structure of xylitol

表1-1 木糖醇与蔗糖的部分理化性质的比较

Table 1-1 Part of the physical and chemical properties of xylitol and sucrose

1.2木糖醇的主要功能

木糖醇是所有食用糖醇中生理活性最好的品种。不论在防龋齿、不增加血糖值、作为糖尿病人食品等方面，木糖醇都显示出了比山梨醇、麦芽糖醇、甘露醇等六碳醇具有特别的优越性。

1.2.1 糖尿病人的甜味剂、 营养补充剂和辅助治疗剂

木糖醇作为一种功能性甜味剂，能参与人体代谢； 进入血液后，不需胰岛素就能透入细胞，而且代谢速度快，不会引起血糖值升高，适合于糖尿病人营养性食糖替代品。根据北京复兴医院临床试验，糖尿病人每天服用30-50g木糖醇，连续服用3-6个月,结果是体力恢复100%；按血糖值测定，降糖有效率达80%， 说明有轻微降低血糖值的效果， 所以我们把木糖醇视为糖尿病人的辅助治疗剂。2002年，国家药品监督管理局将木糖醇批准为（WS₁-XG-2002） 糖尿病人的食糖替代品。

1.2.2 木糖醇的防龋特性

糖是广大群众喜爱的一种有营养的甜食品，特别是儿童最爱吃糖。除糖尿病人外，糖也是病人的保健食品，很多药剂中均含有糖。但是，吃糖太多也没有好处，因为过多的热量会促使肥胖，吃糖太多还有一个问题是产生龋齿。城市里的儿童，就是因为吃糖太多，龋齿率达70%以上。鉴于这些问题， 多年来，很多科学工作者一直在寻求新的食糖代用品以便使健康者吃了不龋齿。早年国外比较成熟的营养性食糖代用品主要是山梨醇、麦芽糖醇和甘露醇， 但这些多元醇防龋齿效果并不理想。此外， 作为一种理想的营养性甜味料， 除了不导致龋齿， 最好是甜度和蔗糖相仿， 并能和蔗糖一样地食用和应用于食品加工工业。试验表明，木糖醇所以有防龋功能，是由于木糖醇不被产生龋齿的细菌所利用；木糖醇在口腔中不产生酸，而是在口腔中转成中性，防止了牙齿被酸蚀。这一试验结果可以说是一个突出的发现，说明果糖能减轻龋齿，而木糖醇能防止龋齿。因此，国际上对于木糖醇作为甜味料应用于防龋食品给予极大的注意。近年来美国 wrigley 公司和丹尼斯克的 Xyrofin 公司，均生产木糖醇防龋口香糖，行销世界各国。丹麦、瑞典、法国、美国均在保健食品商店出售含木糖醇的口香糖和其他食品。我国自70年代开始，先后在北京、浙江开化有关小学，开展了木糖醇防龋齿试验，取得了良好的结果。特别是开化在 237 名小学生和 89 名幼儿中进行口服试验，时间分别为一年和 8 个月。观察结果为，小学生恒牙新龋齿发生率仅 9.09% ，而对照组为 41.67%。幼儿乳牙试验亦有效， 但不如恒牙明显。我国木糖醇无糖糖果生产，最早开始是 70 年代，北京义利食品厂用保定的木糖醇生产了木糖醇奶糖作为特供产品。80年代广州糖果厂生产出木糖醇巧克力，广州罐头厂开发出木糖醇饮料，90 年代中期无锡利夫糖果公司即已利用国产木糖醇，生产一种品牌为”体育生涯”的木糖醇无糖口香糖。

1.2.3 木糖醇改善肝功能

木糖醇能促进肝糖的合成，对肝病患者有改善肝功能和抗脂肝的作用，1972 年日本对此有过个别报导。1974 年经原轻工部环保所推荐， 北京复兴医院曾对病人进行过木糖醇静脉点滴， 发现效果较好。但患者反映输液不仅昂贵，而且麻烦，无法在家中自理。从1987 年11 月至 1979 年 11 月期间，试用口服木糖醇代替输液，治疗乙型迁延性肝炎、乙型慢性肝炎及肝硬化临床试验。在肝炎门诊选择 60 个病例，治疗方法为在原服维生素 B、C 的基础上，增服木糖醇 10-20 g/次，3 次/日， 溶于温开水中， 饭后饮用， 每三个月为一疗程。治疗期间每月复查肝功一次，并系统观察病人的精神状态、 症状变化等。据有完整观察治疗数据的 36 人的统计（其中乙型迁延性肝炎 24 例、 乙型慢性肝炎 7 例、 肝硬化 5 例， 均为明显的肝功能损伤，且经长时间的中西药治疗无效的患者），经过木糖醇治疗三个月后，总有效率分别为：乙型迁延性肝炎为 70.8%，乙型慢性肝炎为 71.3%，肝硬化为80%。

1.2.4 木糖醇的双歧菌增殖作用

我们进行的动物试验表明，木糖醇和低聚糖类相似，也有明显改善小鼠胃肠功能的效果。木糖醇在动物体内肠道中滞留，具有缓慢吸收作用，可促进肠道内有益菌群的增殖，即双歧杆菌的增殖作用。按测算，每人每天服用 15g 左右木糖醇，即可达到调节肠道功能的作用。

除上述几项主要功能以外，木糖醇还具有消除血中酮体的功用。已在北京进行的临床试验证实，由于人体糖代谢异常时，木糖醇照常能代谢，因而可用于手术过程的肠外营养。此外，近两年，国外还发表了木糖醇预防中耳炎以及预防肺部感染新功能的文章，但尚末见到详细的试验数据和临床报告。总之，木糖醇是人类糖代谢的正常中间体，它对人体的生理功能可能还有不少，尚待我们进一步去发现。

1.3木糖醇的应用

1.3.1 食品中的应用

木糖醇与蔗糖有相似的甜度和热值，作为甜味剂被广泛应用于食品中，如糖果，巧克力，点心等。木糖醇具有防龋特性，国际上把木糖醇作为甜味剂应用于防龋食品，如瑞士、芬兰合营的Xyrofin公司，美国的Wrigley公司生产的木糖醇口香糖。此外，由于木糖醇口感清凉，冰冻后效果更好，可用作爽心的冷饮、甜点、牛奶和咖啡等添加剂^[5]。我国从90年代起在食品工业中开始应用木糖醇，木糖醇防龋食品的生产规模和品种都得到了不同程度的发展。

1.3.2 医药中的应用

木糖醇在医药工业中用途广泛。木糖醇是人体糖代谢的正常中间体，无需胰岛素也能透过细胞膜被组织吸收利用，可以有效减慢血液中脂肪酸的生成速度，而且不会使血糖上升，所以木糖醇是糖尿病人理想的治疗剂和营养剂，同时它也是肝炎病人的保肝药物，特别是对糖尿病和肝炎并发症的患者，木糖醇是最理想的药物。日本和欧洲国家在60年代开始用木糖醇治疗糖尿病，我国1972年开始进行临床试验。另外，木糖醇可以作为糖类输液应用于外科手术，且比葡萄糖输液血液成分更稳定，适用于内外科的糖补给。特别在外科手术麻醉及手术后，因糖代谢障碍而不能用葡萄糖时，木糖醇是一种理想的输液剂^[6]。由于木糖醇具有独特的疗效，已成为继葡萄糖、氯化钠注射液之后的新一代营养型载体输液而广泛应用于临床。

1.3.3其他方面的应用

木糖醇作为一种多元醇，广泛应用于化工等行业。木糖醇对人体皮肤无刺激，可作为化妆品类的润湿调整剂用于洗面乳、美容霜、化妆水等卫生用品。木糖醇可用于生产有抑菌性质的表面活性剂、乳化剂、破乳剂、醇酸树脂及涂料，并可以代替甘油用于造纸、牙膏、卷烟生产和国防工业中。由于木糖醇特殊的防龋功能，在牙膏生产中应用木糖醇，有很大的卫生保健意义。此外还可应用于塑料工业，作为主要原料可制成硬质泡沫塑料，作为耐热增塑剂用于生产人造革、塑料凉鞋等，尤其用木糖醇单硬脂酸酯作为表面活性剂添加到农膜中，制得防滴薄膜，可广泛应用到农业生产中。液体木糖醇可用于蓄电池极板制造，电池极板性能稳定，容易操作，成本低，效果比甘油更佳^[7]。

2.氧化葡萄糖酸杆菌的代谢特性

2.1氧化葡萄糖酸杆菌的基本特性

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，细胞呈椭圆状或杆状，属于醋酸杆菌科(Acetobacteraceae) ^[8]，化能异养型，呼吸链的末端电子受体为氧气^[9]。

氧化葡萄糖酸杆菌喜生活在酸性的高糖、高醇环境中，因此可以从花园土壤、水果、果酒中分离获得。它能够引起水果，饮料的腐败，但对人和动物没有任何不良的影响^[10]。其生长最适温度25-30 #176;C，最适pH5.5-6.0，在弱碱性培养基中稍生长^[11]。

2.2氧化葡萄糖酸杆菌的代谢特性

G. oxydans对于糖、醇的代谢有两种路径，在这类菌中存在两种酶系统，这些酶系统在细胞里的位置及功能都有所不同。第一类代谢途径及酶系主要在胞内，通过磷酸戊糖途径（PPP）将糖和多元醇降解为二氧化碳^[12]。醋酸杆菌没有果糖磷酸酶缺少糖酵解过程，氧化葡萄糖酸杆菌缺乏琥珀酸脱氢酶具有不完整的TCA循环，所以不能完全氧化醋酸生成二氧化碳和水^[9]。以磷酸戊糖途径和ED途径代谢相关酶的编码基因已经确定，目前认为磷酸戊糖途径是氧化葡萄糖酸杆菌代谢的途径。底物醇、糖进入该菌磷酸戊糖途径时先由激酶将底物磷酸化，然后再由NAD(P) -脱氢酶和异构酶进一步降解^[13]。

第二类途径也叫做直接氧化途径，底物氧化是由位于细胞质膜与呼吸链相耦联的脱氢酶参与催化的。这些酶的活性中心朝向周质空间，因此底物只需要穿过外层膜而不用转移至胞质，氧化产物（醛、酮、酸等）可以直接分泌到培养基中。氧化葡萄糖酸杆菌这一显著的优点，使其在工业生物催化中大受青睐。

2.3氧化葡萄糖酸杆菌的醇脱氢酶学特性

G. oxydans中有两类脱氢酶系统，膜结合脱氢酶(Membrane-bound dehydrogenase)和可溶性脱氢酶(Soluble dehydrogenase)^[14-15]。位于细胞质膜上与细胞色素连接的脱氢酶，负责重要底物的快速氧化，遵循Bertrand-Hudson法则，通常在pH 5.5时具有最高的催化活性，产物直接分泌到培养基中^[16]。而位于细胞质中可溶性脱氢酶，则被认为是参与生物合成前体物质的氧化用以维持细胞平台的生长，在pH 8.0时具有最高的催化活性，且对底物的专一性并不遵循任何一个简单的规则。这一组酶的产物将在代谢途径中异化^[17]。

1.2.3.1 膜结合脱氢酶

在过去几十年中，许多重要的膜结合脱氢酶被发现和鉴定，这些酶主要包括L-山梨糖脱氢酶^[18] 、D-山梨醇脱氢酶^[19]、乙醇脱氢酶^[20]、葡萄糖酸脱氢酶^[21]等等。许多膜结合脱氢酶都是利用PQQ作为辅基转移电子，PQQ是G. oxydans 621H利用生长的必需因子^[22]，那些不能合成PQQ的突变菌株将无法利用多元醇（如D-甘露醇、D-葡萄糖、甘油等）作为它们生长的能量来源。

1.2.3.2 可溶性NAD(P)-醇脱氢酶

在细胞质中，有一系列的NAD(P)-醇脱氢酶，最适反应 pH 8.0-11.0 ^[23]，这些醇脱氢酶在菌体生长期不提供能量，共包含了6种不同的可溶性多元醇脱氢酶，这些脱氢酶底物特异性广泛，都有对应的NAD(P)和辅酶参与反应^[23-24]。

1.2.3.3木糖醇脱氢酶

木糖醇脱氢酶(EC1.1.1.9)是酵母菌中木糖代谢的关键酶之一。木糖首先在木糖还原酶的作用下转化为木糖醇，然后由木糖醇脱氢酶的催化转化为木酮糖。氧化葡萄糖酸杆菌中发现两种木糖醇脱氢酶，一种称为XDH1，另一种为XDH2。XDH1有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，XDH2在序列表中有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，通过SDS-PAGE凝胶电泳测得XDH1和XDH2的分子量分别为大约36-40 KDa和27-30 KDa。这两种木糖醇脱氢酶统称为”XDH”^[25]。

Ehrensberger等^[26]报道了来自氧化葡萄糖酸杆菌NAD 特异性的木糖醇脱氢酶全酶的晶体结构，并公布其3D结构图像（图1-6所示）。木糖醇脱氢酶的底物特异性主要与Asp38和Met39有关，在活性不减弱的情况下，通过双突变使得该酶能够利用NADP 。

3.关于氧化葡萄糖酸杆菌的磷酸戊糖途径

磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）是生物体糖代谢的重要途径，主要生理功能是产生供还原性生物合成需要的NADPH ，可供核酸代谢的磷酸戊糖以及一些中间产物可参与氨基酸合成和脂肪酸合成等。其中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的两个关键酶。磷酸戊糖途径途径可分为两个阶段，第一阶段由G-6-P脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯开始，然后水解生成6-磷酸葡萄糖酸，再氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖。NADP 是所有上述氧化反应中的电子受体。第二阶段是5-磷酸核酮糖经过一系列转酮基及转醛基反应，经过磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中间代谢物最后生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，后二者还可重新进入糖酵解途径而进行代谢。

3.1 组成该途径的主要关键酶

3.1.1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

G6PDH 是磷酸戊糖途径的限速酶，控制着这条途径的碳流和还原力 NADPH 的产生^[27-28]。G6PDH 催化产生的 NADPH 为细胞内某些生物大分子的生物合成提供了还原力。G6PDH的酶活力高低取决于底物G6P和NADP 的浓度，同时受到NADPH含量的调控。

G6PDH (zwf, older name: Zwischenferment) 广泛存在于动植物微生物细胞中，由无活性的亚基单体通过NADP 连接成活性酶，分子量分布范围在206~240kDa。重组人源G6PDH已经实现并完成了晶体结构解析。研究结果显示鼠源和兔源G6PDH已经实现纯化并解析。鼠源G6PDH具有两个活性位点，并且它们对于底物G6P的K_m分别为29和41μM；而兔源G6PDH对底物G6P的K_m为65μM。报道的两种G6PDH对于辅酶NADP 的表观K_m分别为17和4μM。NADPH是各种G6PDHs非常强的竞争性抑制剂，其表观抑制常数K_i为3.5μM。

由此可得该酶的表观抑制常数K_i低于辅酶NADP 的表观K_m值，因此细胞质中[NADP ] / [NADPH]比值的高低决定了该途径通过G6PDH处的代谢通量。

3.1.2 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH）是磷酸戊糖途径的关键酶之一，它和PPP途径中葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)组成生物体厌氧细胞中NADPH(niotinamide adenine dinueleotide phosphate)的主要资源^[29]。6PGDH在人类的研究中较早,研究表明其广泛存在于人体大多数组织中^[30]。在细菌中，6PGDH的氧化过程伴随着NAD 和NADP 的还原，NADP 依赖的6PGDH受葡萄糖酸的诱导，促使己糖向戊糖磷酸途径转移，而NADP 依赖的6PGDH呈组成性表达不受糖类诱导^[31]。由于NADPH的存在，降低了生物体在物质合成过程中的能量，例如动物体内脂肪酸和胆固醇的生物合成，在研究老鼠脂肪合成代谢途径时发现，脂肪合成消耗了大量的6PGDH，暗示了脂肪等代谢合成时在动物体内大量的6PGDH被激活。6PGDH在维持细胞NADPH水平上起着重要的作用，当6PGDH酶活性发生任何一点的改变都会影响到生物体能量的平衡、生长速率和细胞的活力^[32]。

3.2 该途径的代谢特点

磷酸戊糖途径是氧化葡糖酸杆菌中间产物代谢的主要途径，它不仅担负着为呼吸链提供质子、代谢产能、准备生长所需中间产物等功能，还有一项就是调节NADH与NADPH的比例维持二者在胞内的相对平衡^[33-39]。

图1 G.oxydans细胞中与辅酶循环相关的关键酶及代谢路径

Fig 1 Enzymes and metabolism involved in cofactor regeneration in Gluconobacter oxydans

Tonouchi研究氧化葡萄酸杆菌的PPP关键酶G6PDH和6PGDH发现，它们具有双辅酶特异性^[33]。Rauch等则通过克隆相关基因外源表达得到G6PDH和6PGDH纯酶，并分别测定其在不同辅酶存在时的动力学数据^[34]。

表 1 两种脱氢酶的动力学数据

Tab 1 Kinetic parameters of the DHs

DHs	Substrate	KM(mM)	kcat (s-1)	kcat/KM (M-1s-1)	Cofactors	KM （μM）	Vmax（U/mg）
G6PDH	G6P	0.44	23	5.45#215;104	NAD NADP	64.0 440	41.7 41.5
6PGDH	6PG	0.28	44.1	1.57#215;105	NAD NADP	740 26.4	47.6 47.6

研究发现作为氧化葡糖酸杆菌核心代谢的磷酸戊糖途径可以促进NADH的再生循环和积累，而与之相关的两个关键酶分别由基因zwf和gnd编码。其中zwf合成的葡糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH 是整个途径的限速酶与代谢阀门。这两个酶都具有对NADP/NAD的双辅酶依赖性，但是在氧化葡糖酸杆菌生理条件下，G6PDH倾向与依赖NADP产生NADPH，6PGDH倾向于依赖辅酶NAD产生NADH。另有研究表明氧化葡糖酸杆菌胞内存在可以将NADPH转化为NADH由gox0310-0312编码的氢转移酶^[37-39]。

4课题研究内容与意义

4.1 研究内容

氧化葡萄糖酸杆菌的培养以及生长曲线的测定;

探索以氧化葡糖酸杆菌为生物催化剂转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇的最佳转化条件;

氧化葡萄糖酸杆菌木糖醇脱氢酶酶活检测方法的建立。

4.2研究意义

木糖醇是一种优良的功能性甜味剂和重要的平台化合物，在食品、医药、国防、塑料和轻工行业中具有广泛的应用前景。目前，木糖醇主要以化学法和化学生物法进行工业化制备，该法普遍存在能耗高、污染大等问题。特别是近年来，随着燃料乙醇等产业的迅猛发展，直接导致秸秆等原料的日益紧缺，限制了以木糖为原料生产木糖醇的发展。近年来，以自然界中价廉易得的葡萄糖为底物全生物法制备木糖醇受到国内外高度重视，并成为新的发展方向。全生物法制备木糖醇是一条很有前景的绿色生产工艺，如果能寻找到合适的微生物菌株及其酶，可使该工艺简单、 高效， 在经济上完全能与目前所使用的化学法和化学生物法竞争。该工艺的实现，将有利我国木糖醇工业的可持续发展，并将促使我国木糖醇生产技术进入世界先进行列，因此全生物法工艺的开发具有深远的社会与经济价值。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案