摘 要

全细胞生物催化剂可以进行许多工业相关的化学反应。虽然它们比纯化酶便宜，但由于细胞膜施加的转运阻力，整个细胞的反应速度受到固有的限制。此外，还需要固定生物催化剂，使其易于从反应混合物中分离。本文利用LBL自组装形成一个聚多巴胺细胞外壳，细胞外壳还保护生物催化剂免受各种外部压力的影响，包括:干燥、冻融、高温、渗透冲击以及溶菌酶的酶攻击和原生动物的捕食。

贻贝灵感的聚多巴胺（PDA）涂层是一种很有前途的表面改性途径，PDA涂层具有简单性和多功能性。聚多巴胺（PDA）涂层一般是通过多巴胺在基础介质中自发氧化合成，但是该方法不适用于碱性敏感材料，其在碱性介质中具有差的稳定性并且需要过长的反应时间。一般使用一些强氧化剂被用来加速碱性环境中多巴胺的氧化，具有高氧化活性的高碘酸盐可以有效氧化多巴胺并实现PDA涂层的均匀沉积，但是利用强氧化剂或者金属离子对环境不利，可能导致污染，同时这些强氧化过程不易调节，生成的PDA涂层会随着时间的推移而增长。

本文采取了利用光敏材料催化溶解氧促进多巴胺氧化聚合，常规方法是在ph8.5的缓冲液中由氧气自发促发多巴胺聚合。光敏材料催化是在ph为7.0的Tris缓冲液中加入光敏材料（9-均三甲苯基-10-甲基吖啶高氯酸盐），在光照的情况下光敏材料变成高氧化能力的电子转移态，促进溶解氧气在中性环境下促进多巴胺聚合形成聚多巴胺涂层。

本文比较了用光催化法在中性条件下合成的聚多巴胺（PDA）涂层和常规途径合成的聚多巴胺（PDA）涂层包裹大肠杆菌后，大肠杆菌的催化活性的高低，以及聚多巴胺（PDA）涂层包裹后大肠杆菌耐受性的改变。

关键词：多巴胺，聚多巴胺，光敏材料，纳米结构，单细胞固定，表面改性

Preparation and application of polydopamine-immobilized escherichia coli cells

Abstract

Whole - cell biocatalysts can perform many industrial - related chemical reactions.Although they are cheaper than purified enzymes, the reaction speed of the whole cell is inherently limited by the transport resistance imposed by the cell membrane.In addition, the biocatalyst needs to be fixed so that it can be easily separated from the reaction mixture.In this paper, a polydopamine cell shell was formed by LBL self-assembly. The cell shell also protected the biocatalyst from various external pressures, including drying, freeze-thaw, high temperature, osmotic shock, lysozyme enzyme attack and protozoan predulation.

Mussel - inspired polydopamine (PDA) coating is a promising surface modification approach.Polydopamine (PDA) coating is generally synthesized through the spontaneous oxidation of dopamine in the basic medium, but this method is not suitable for alkaline sensitive materials, which have poor stability in the alkaline medium and require too long reaction time.Generally use some strong oxidant is used to accelerate the alkaline environment of dopamine oxidation, high oxidation activity of periodate and PDA coating can effectively dopamine oxidation and achieve uniform deposition, but bad for the environment of strong oxidizer or metal ions, may cause pollution, at the same time these strong oxidation process is not easy to adjust, the generated PDA coating grows over time.

In this paper, photosensitive materials were used to catalyze dissolved oxygen to promote the oxidative polymerization of dopamine.Photocatalytic method is to add 9-trimethylidene-10-methyl acridine perchlorate into buffer solution with ph 7.0 as photosensitive material, which turns into electron transfer state with high oxidation capacity under the condition of light, and promotes dissolved oxygen to promote dopamine polymerization to form polydopamine coating under neutral environment.

In this paper, the catalytic activity of escherichia coli and the tolerance of escherichia coli were compared between the PDA coating synthesized by photocatalysis under neutral condition and the PDA coating synthesized by conventional route.

Keywords: dopamine, polydopamine, photosensitive materials, nanostructures, single-cell fixation, surface modificatio

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1. 全细胞生物催化 1

1.1.1. 全细胞生物催化技术的介绍 1

1.1.2. 全细胞生物催化的方法 2

1.1.3. 单细胞固定化技术介绍 2

1.1.4. 单细胞固定的方法 3

1.2. 多巴胺简介 3

1.3. 聚多巴胺 4

1.3.1. 聚多巴胺介绍 4

1.3.2. 聚多巴胺涂层的应用 5

1.3.3. 常规合成聚多巴胺涂层的缺点 6

1.4. 光敏材料 6

1.4.1. 光敏材料的介绍 6

1.4.2. 光敏材料作用原理 7

1.4.3. 光敏材料的优点 7

1.5. 本课题研究的意义与内容 8

1.5.1. 本课题的研究意义 8

1.5.2. 本课题研究的主要内容 8

第二章 材料与方法 10

2.1. 实验材料和设备 10

2.1.1. 主要试剂和材料 10

2.1.2. 实验仪器 10

2.2. 培养方法 11

2.2.1. 种子液培养方法 11

2.2.2. 摇瓶发酵培养 11

2.2.3. 离心收菌 11

2.3. 聚合方法 12

2.4. 活性检测方法 12

第三章 结果与讨论 13

3.1. 光敏材料对聚合的影响 13

3.1.1. 中性环境下加入光敏材料对聚合效果的影响 13

3.1.2. 不同浓度光敏材料对吸光值的影响 14

3.1.3. 不同光源对吸光值的影响 15

3.1.4. 加入光敏材料对细胞的影响 16

3.2. 聚合条件的优化 17

3.2.1. 光敏材料浓度对催化效果的影响 17

3.2.2. 不同浓度大肠杆菌下的聚合效果 18

3.2.3. 不同聚合时间下的催化效果 18

3.2.4. 不同光源下聚合催化效果 19

3.3. 中性环境下催化活性 19

3.4. 表征 20

3.5. 聚多巴胺涂层的应用 22

3.5.1. 加入表面活性剂后催化效果 22

3.5.2. 重复利用率 23

3.5.3. 聚多巴胺与纳米磁性颗粒结合 24

第四章 结论与展望 25

4.1. 结论 25

4.2. 展望 25

参考文献 26

致谢 30

文献综述

全细胞生物催化

全细胞生物催化技术的介绍

全细胞生物催化剂可以进行许多工业相关的化学反应。虽然它们比纯化酶便宜，但由于细胞膜施加的转运阻力，整个细胞的反应速度受到固有的限制。此外，还需要固定生物催化剂，使其易于从反应混合物中分离。在本文中我们使用了一个(LbL)自组装过程来创建一个微生物外壳，同时固定化、保护和增强整个细胞生物催化剂的反应活性。在本次实验中我们使用表达P450酶的大肠杆菌作为模型生物催化剂，在其表面进行多巴胺的聚合形成聚多巴胺涂层，微生物外壳（聚多巴胺涂层）还保护生物催化剂免受各种外部压力的影响，包括:干燥、冻融、高温、渗透冲击以及溶菌酶的酶攻击和原生动物的捕食^[1]。

近年来，蛋白质工程的关键进展导致生物催化技术取得了非凡的进展。生物催化技术目前被广泛用于工业规模生产大宗商品化学品、制药和精细化学品。酶具有很高的催化能力^[2][3],在温和的反应条件(pH、温度和压力)下工作，对底物有很大的选择性。与纯化酶相比，全细胞生物催化剂有几个优点，包括:消除了蛋白质纯化的需要，能够催化比酶或途径更需要的多步骤转化，以及易于再生辅助因子。然而，细胞包膜的屏障功能降低了反应速度，通常比纯化酶低12个数量级。全细胞生物催化剂反应速率的降低可能会抵消去除蛋白质纯化步骤所带来的经济效益。提高全细胞生物催化剂的反应活性、稳定性和实用性，可以确保全细胞生物催化剂在经济上与纯化酶竞争。提高全细胞生物催化剂的反应速率有许多策略，从渗透细胞膜的化学处理到酶或膜的分子工程。使用有机溶剂、洗涤剂、盐、冷冻/解冻和电渗等方法对细胞膜进行渗透，已被广泛用于提高生物催化的速率，但是，膜的一般失稳可能导致细胞完整性的丧失，限制寿命和稳定性。

全细胞生物催化的方法

为了稳定和改善整个细胞生物催化剂的功能，已经有许多技术被使用，包括絮凝、表面固定化和封装。所有固定化方法的一个显著特点是易于从反应混合物中分离生物催化剂，通过重复使用使生物催化剂得到更大的利用，并具有连续处理^[4][5]的潜力。絮凝作用是指添加一种化学物质，使细胞聚集，并允许较大的颗粒被过滤，它允许生物催化剂从反应混合物中分离出来，但不能以连续的方式进行。表面固定化通常使用廉价的载体材料，如粘土或活性炭，结合结合剂^[6]。这种方法不会增加扩散电阻，因为如果在细胞的顶部涂上任何涂层，扩散电阻就很小。因此，它对生物催化剂细胞几乎没有保护作用，因为它们可以从表面分离，导致活性损失。封装的一个固有的缺点是增加了扩散长度和降低了有效扩散率，这将导致较低的反应速率。采用逐层自组装(LbL)技术，可以在细胞表面直接沉积纳米结构涂层，同时固定、增强和保护整个细胞生物催化剂，同时最小化扩散限制。本文采用LbL自组装技术使聚多巴胺涂层一层一层的包裹在大肠杆菌的表面，对大肠杆菌进行固定，提高大肠杆菌的催化活性。

单细胞固定化技术介绍

受到活生物体中细胞特征的启发，已经设计了新型杂交体，其包含具有多种结构和功能的活细胞和非生物材料。细胞的性质反映在生物化学过程的选择性，活性和自我调节以及可重新编程性。在细胞中产生非天然功能的能力可能具有技术和科学意义^[7]。其中单细胞被纳米材料包覆，以增强细胞的稳定性和活性，并为细胞提供一些通常完全不同的非生物功能。 纳米壳中的单细胞在许多应用中具有巨大潜力，包括生物电子学，细胞保护，细胞疗法和生物催化。单细胞纳米封装形成细胞内结构，为赋予活细胞以程序化方式的外源性特性提供了化学工具，比如级联有机催化、紫外线过滤、免疫原性屏蔽，以及增强现实环境中对致命因素的体外耐受性^[8]。在纳米壳中开发具有非天然功能的单细胞的能力在能量产生^[9]，环境修复^[10]，生物催化^[11]和生物医学方面具有重要意义。单细胞被纳米材料包覆，以增强细胞的稳定性和活性，并为细胞提供一些通常完全不同的非生物功能。

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