1.1课题简介： 现如今，人们对食品安全，营养日益重视，食品已不仅仅是满足人们生存的基本需求品，食品行业的发展越来越迅速，相关食品的技术也日新月异地发展着，酶作为一种高效催化剂对食品的影响是很重要的。

四氢嘧啶和5-羟化四氢嘧啶作为相容性物质，不仅可以调节渗透压，还可以稳定蛋白结构，在医药、生物制造和化工行业具有广阔的发展前景，但5-羟化四氢嘧啶作为渗透压保护剂及对蛋白的保护作用要优于四氢嘧啶和其他相溶性物质。

四氢嘧啶羟化酶（EctD）属于Fe 2 与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族，EctD在催化反应中体现作用底物的专一性，主要催化四氢嘧啶生成5-羟化四氢嘧啶，是微生物发酵生产5-羟化四氢嘧啶过程中的关键酶，因此四氢嘧啶羟化酶和5-羟化四氢嘧啶都已受到广泛关注。

我们将就EctD的克隆表达与性质研究进行综合分析和研究。

1.2 EctD简介 1.2.1 EctD的来源 拥有EctD基因的微生物在生理、生活方式和栖息地分类上相对多样化，它们中有的来自病原菌，如脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）和波氏杆菌属（Bordetella)的多个菌株；有的来自在抗生素生产方面具有重要作用的微生物，如天蓝色链霉菌 （Streptomyces coelicolor）和灰色链霉菌（S.griseus）；有的是生长在极低或极高温度环境中的细菌，如嗜热芽孢杆菌（Geobacillus sp.Y412MC10）和嗜冷鞘脂单胞菌（Sphingopyxis alaskensis），以及生长在极端pH环境中的细菌，如欧氏碱湖生菌（Alkalilimnicola ehrlichei）；大部分拥有ectD基因的微生物生长在高盐或海洋环境中，如海洋细菌泊库岛食烷菌（Alca-nivorax borkumensis SK2）[1]。

Bursy等通过氨基酸序列比对检索发现，有46株革兰阳性或阴性菌的EctD与需盐枝芽孢杆菌的EctD的氨基酸同源性高达61%~73%，其中ectD基因位于ectABC基因簇下游的有30种，而剩余的16株中ectD基因并不与ectABC基因相连[2]。

ectD基因片段的大小随菌株来源不同而不等，一般约为1 kb，如来自需盐色盐杆菌（Chromohalobacter salexigens）的ectD-1基因为996 bp（GenBank：ABE60347.1），ectD-2基因为942 bp（GenBank：ABE57904.1），而来源于需盐枝芽孢杆菌的ectD基因为900 bp（Gen-Bank：AAY29689.1）[1]。

尽管不同来源的EctD的氨基酸序列同源性有所不同，但它们的保守位点，如与2-酮戊二酸及Fe2 的结合位点基本相同，说明ectD基因在进化上是相对保守的。

[1-11]序列同源性比对检索发现，ectD与脯氨酸羟化酶基因、人类植烷酸-辅酶A羟化酶（phytanoyl-CoA hydroxylase，PhyH）基因具有较高的同源性，同属于Fe2 与2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶超家族，都存在结合Fe2 的保守2-His-1-羧酸酯面三联体[2]。

不同来源的EctD与指孢囊菌RH1中L-脯氨酸-4-羟化酶（GenBank：D78338.1）的氨基酸序列同源性为26％~32％[13]。