摘 要

抗生素被广泛用于一些感染性疾病的处理，但医疗以及部分养殖用抗生素的滥用导致细菌产生了耐药性。而作为耐药性的一个重要原因，抗性基因已经被认为是一种新型的污染物。人类活动会导致抗性基因在各种环境介质中进行传播，尤以水环境为主要传播途径。而饮用水水厂又多以河流、湖泊等天然水体作为水源，这就导致饮用水中的抗性基因最终会富集在人类体内，对人类的健康安全造成极大的威胁。

本研究通过对水厂处理工艺流程中处于不同阶段的原水、砂滤池出水、沉淀池出水、深度处理出水、出厂水进行磺胺类基因sul1和sul2的qPCR检测，同时将抗性基因浓度进行比较，在对qPCR检验技术进行特异性验证之后，研究处理工艺对抗性基因浓度的影响以及相应的处理效果。研究成果如下：

1. 通过对qPCR检测技术进行特异性验证，表明其能很好的将目的基因进行扩增，这有利于后续检测抗生素抗性基因数据的分析；
2. 在饮用水厂处理过程中，水环境中的抗生素抗性基因能够很好地被去除，其绝对浓度从10²~10³拷贝数/升降到了10^-1~10^-2拷贝数/升，但在砂滤池出水阶段其绝对浓度有一个较为明显的提升；
3. 饮用水厂处理过程中，抗生素抗性基因的相对丰度会有一个较为明显的提升，其相对丰度提升了两个数量级，这表明抗性基因能够在环境介质中得到很好的传播。

关键词：抗性基因；饮用水；DNA提取；PCR检测；特异性验证

Abstract

Antibiotics are widely used in the treatment of some infectious diseases, but the abuse of medical and some antibiotics for breeding has led to bacterial resistance. As an important cause of drug resistance, resistance genes have been considered as a new type of pollutant. Human activities lead to the spread of resistance genes in various environmental media, especially the water environment as the main route of transmission. Drinking water plants often use natural water bodies such as rivers and lakes as water sources, which leads to the accumulation of resistance genes in drinking water, which poses a great threat to human health and safety.

In this study, the qPCR detection of sulfonamide genes sul1 and sul2 was carried out on the effluent at different stages in the water treatment process of the water plant. The raw water, sand filter effluent, sedimentation tank effluent, deep treatment effluent, and concentration of resistance genes in the factory water were obtained. For comparison, after the specific verification of the qPCR test technique, the effects of the resistance gene concentration during the treatment and the corresponding treatment effects were studied. The research results are as follows:

(1) Through the specific verification of qPCR detection technology, it shows that it can well amplify the target gene, which is beneficial to the subsequent analysis of antibiotic resistance gene data;

(2) During the treatment of drinking water plants, the antibiotic resistance gene in the water environment can be well removed, and its absolute concentration is reduced from 10²~10³ copy number / liter to 10^-1~10^-2 copy number / liter, but in the effluent stage of the sand filter Its absolute concentration has a more obvious improvement;

(3) During the treatment of drinking water plants, the relative abundance of antibiotic resistance genes will be significantly improved, and Its relative abundance has increased by two orders of magnitude, indicating that the resistance genes can be obtained in environmental media.

Keywords: Antibiotic resistance genes; Drinking water; DNA extraction; PCR testing; Specific verification

目录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

1.1抗生素的污染现状 1

1.2抗性基因污染 1

1.3 饮用水中的抗生素抗性基因 2

1.4检测方法介绍 3

1.4.1传统培养法 3

1.4.2普通PCR检测方法 3

1.4.3荧光定量PCR法 4

1.5研究内容与目标 4

1.5.1研究目标 4

1.5.2研究内容 4

1.6技术路线 5

第2章实验材料与方法 6

2.1饮用水厂工艺介绍 6

2.2典型抗生素抗性基因 6

2.3样品采集与处理 6

2.4基因组DNA的提取 6

2.5 qPCR实验准备 7

2.5.1抗性基因特异性引物 7

2.5.2抗性基因荧光试剂 8

2.6 qPCR实验方法 8

第3章 检测技术验证与分析 11

3.1 模板DNA浓度检测 11

3.2 qPCR特异性验证 11

3.2.1 扩增曲线 11

3.2.2 熔解曲线 17

3.3抗性基因的绝对浓度 18

3.4抗性基因相对丰度 21

3.5本章小结 22

第4章 结论与建议 23

4.1结论 23

4.2建议 23

致谢 24

参考文献 25

第1章 绪论

1.1 抗生素的污染现状

抗生素在19世纪末被人们发现，那时几乎所有的细菌传染病都能被其轻易治愈。因此，它们被广泛用于控制人类传染病和家畜养殖，拯救了无数生命。它也为传染病的治疗和人类的可持续发展作出了重大帮助。这是人类历史上的一个重大发现^[1]。

在世界范围内，抗生素被用于人类医疗的生产和使用。同时，因为有促进疾病的预防和家畜的成长的效果，在畜牧水产以及养殖业中，兽用抗生素也被当作促生长剂长期添加于动物饲料中。目前来看，全球几乎所有地区都釆用抗生素来实现提高经济效益的目的。随着人们使用抗生素的范围越来越广，用量越来越大，近几年来，全球的抗生素使用量增加了36%^[5]。

但人们对抗生素的认识却没有进一步加深，抗生素滥用不可避免。特别是在医疗系统和水产养殖业，中国的抗生素管理与发达国家相比相对宽松，导致长期滥用和药物系统使用不当，国内使用的抗生素大多数只有15％被吸收和使用，剩余的通过人类的排泄途径排入自然生态系统。通过对36种常用抗生素调查结果显示，2013年中国抗生素使用量约为92700吨，其中约53800吨可通过各种途径进入自然环境。主要原因是由于人体内抗生素积累较少，只有一小部分人体吸收代谢反应产生非活性产物，剩余约60％至90％的抗生素是原样随代谢物排出体外。在体外，它不断进入环境，以各种方式污染环境^[4]。据报道，近年来，在被生活污水，城市污泥，垃圾渗滤液和城市污泥污染的土壤中可以检测到抗生素的存在^[7]。

1.2 抗性基因污染

抗生素等新型污染物的大量使用并以代谢产物的形式和原形态经各种途径进入环境，导致环境生物或细菌中抗性基因的产生、本土细菌的变性、水和土壤等环境受到了污染并使得生态系统遭到了侵害。抗性基因的传播导致耐药性从非病原性细菌转移到病原菌，并进一步传播、发展成生态水平的耐药性，因此未接触到抗生素的个体也能产生耐药性^[4]。细菌耐药性是指通过天然突变，外源基因获取等方法使得药敏性细菌获得耐药性，引起遗传性状或其他生理性状改变，导致其对抗生素的敏感性急剧降低甚至不再敏感^[7]。细菌耐药性的提高，导致更多抗生素效果减弱甚至失效，对人类健康和经济生产产生严重危害，必须控制其传播^[9]。

抗生素的滥用还导致了新型环境污染物抗生素抗性基因（ARGs）和抗性细菌（ARB）的出现，其在不同环境介质中的传播扩散可能比抗生素本身的危害更大^[4]。抗性基因基本上能编码不同的抗生素抗性，而且是遗传信息的特殊序列，其可以通过各种形式的移动遗传元件（例如质粒，整合子，转座子和插入序列）突破细菌物种的种属关系而得到广泛传播，导致污染的加重^[14]。随着对细菌耐药性问题理解的加深，人们也逐渐意识到，广泛生产和滥用抗生素可在环境中集中和传播ARGs并促使它逐渐蔓延到全球^[7]。事实上几乎在所有的环境媒介中都能检测到ARGs的存在，有关从河流、湖泊、地下水、饮用水和土壤等环境检出抗生素抗性基因的报道越来越多^[5]。

抗性基因会通过食物链进入人体内，威胁公共健康和食品、饮用水安全等，而且一旦其进入致病微生物，将直接影响对疾病的治疗效果，人类可能面临无法使用药物的情况，最重要的是它可能对周围环境造成威胁^[5]。抗性基因作为可移动的遗传因子能通过遗传和水平基因转移在亲代和其他菌种间传播扩散，对人类健康和生态平衡造成危害^[10]。由于ARGs可以在生物体内永久和持续传播，释放到环境中的DNA即使在携带的细胞死亡的情况下也会被保护，最终会侵害其他细胞，因此，环境中ARGs的持久残留，细菌之间的转移，转化和扩散比抗生素残留物本身对环境和生态的危害更大。同时，由于ARGs的稳定性，导致即便周围存在对生存以及繁殖方面造成威胁的温度、渗透压变化以及抗生素的使用等情况时，其也能够稳定存在^[11]。

1.3 饮用水中的抗生素抗性基因

因为人们各种行为的影响，尤其是我国人口众多，都极大的促使了抗生素和抗性基因在环境中的迁移、传播和扩散，而且其也能够在某些环境当中富集。地表水生环境对人们的行为活动并没有很强的抵抗能力，同时因为是城市污水的受纳水体，其能够容纳多样丰富的抗生素，以致成为内在和外来抗生素抗性基因的反应器。因此水生环境既可以成为抗生素抗性基因的存储介质，又可以成为传播的渠道，将原先可能只有很小的受污染范围传输到一个更大的范围内。这些都更加加重了抗生素抗性基因的环境污染^[12]。

目前在各国的河流和湖泊中，主要从城市污水和水产养殖废水中检测出各种抗生素和抗性基因。例如在长江当中，根据报道已经检验超出100种抗性基因，而且其相对丰度可达20%以上；以长江为水源的某饮用水厂出水中也检验出多种抗性基因，说明长江流域受到抗生素抗性基因污染的情况比较严重^[6]。目前，关于在地表水，污水和饮用水中检测到有抗性基因污染的报道相对普遍，抗性基因的传播在不同的水生环境中也相对复杂。Chen等^[4]对中国南方珠江和珠江口中的抗性基因和I类整合子的调查也说明，所有的河流样品中均检测出sul1，sul2基因和I类整合子，并且抗性基因的相对丰度受人们行为活动的影响很大，其跟随者水流方向也有较为明显的传播。

城市的大部分饮用水都是以附近的河流作为水源，并经过适当的工艺处理后提供给人们饮用。但是因为地表水环境中检测出抗生素抗性基因的频率很高，使得抗性基因能经过饮用水处理设备进入自来水分配系统，导致自来水污染。Xi等^[7]研究了美国密歇根州和俄亥俄州的饮用水源、饮用水厂的出水中的抗性素抗性基因，发现饮用水中的细菌对某些抗生素的抗性相比于水源增强了很多，并且饮用水中大多数的抗性基因相对丰度高于饮用水源。Guo等^[4]研究了长三角洲7个饮用水厂供水系统中的磺胺类抗性基因，并从其中两个饮用水厂的出厂水中检测到了抗性基因。无论是饮用水源还是生活用水中，甚至在矿泉水中都检测到了抗生素抗性基因，说明饮用水中的抗性基因污染已经十分严重。

1.4 检测方法介绍

当前检测环境介质中抗性基因的方法主要包括以培养细菌为基础的传统培养法和基于现代分子生物学技术的非培养法。使用常规培养方法评估细菌中的抗性基因可导致偏差，因为环境中的大部分细菌不能在人工条件下进行培养。而随着分子生物学技术的发展和不断完善，非培养法的应用为抗性基因的研究提供了巨大的潜力与便利。当在环境介质中检测抗生素抗性基因时，现代分子生物学技术常要结合传统的细菌培养法^[9]。

1.4.1传统培养法

传统培养法是指制备含有不同营养素的琼脂平板，将稀释到一定程度的菌种样品涂抹到平板上，同时将平板放置于事先设定好温度的环境中来培养微生物的方法。培养后检查菌落数，每个菌落数等于原水样中的一个细菌，并根据稀释的倍数换算成样品中含有的细菌数。同时，这种方法可以用来观察细菌形态，也可用于筛选、分离和检测环境介质中抗性细菌内携带的特异性抗性基因片段。虽然环境中的大多数微生物不能在人工条件下培养，但这种传统培养法操作简单、灵活、成本低且高度标准化，因而仍然可以在在一些抗生素抗性基因研究中发挥作用^[12]。

同时，传统培养法可用于评估微生物对抗生素的抗性。通过向选择培养基中加入合适量的抗生素，能够承受这种浓度的微生物可以被认为是抗性细菌，并且根据其数量相对于总菌落数的占比可以评估出微生物对一种或多种抗生素的抗性，而且也可以在相当程度上了解抗生素抗性基因在环境中的传播和归趋。抗性细菌的鉴定可以通过传统的生理和生化方法进行，例如观察菌落形态和生长特征，生化实验等，当然也可以通过自动分析仪器进行检测与验证^[13]。

1.4.2普通PCR检测方法

聚合酶链式反应是使用生物体细胞外聚合酶合成特定DNA片段的方法。PCR技术一般需要进行包括高温变性、低温退火和适温延伸在内的三个步骤的反复循环，这可以快速特定地在体外扩增目的DNA^[11]。基本PCR技术的原理是在模板DNA、上游和下游引物、Mg² 、dNTP存在下，在特定热稳定酶的催化作用下完成反应。这种方法特异性强，易于操作且有高灵敏度。常规PCR技术不仅可用于ARGs的定性分析，还可用于结合其他方法检测ARGs和抗性细菌。例如结合传统的微生物培养法，可以检测纯菌株携带的ARGs；结合变性梯度凝胶电泳技术对携带ARGs的微生物进行物种鉴定，还可以研究在抗生素作用的压力下的微生物群落结构的变化。

1.4.3荧光定量PCR法

因为常规PCR检测技术无法准确定量抗性基因，因此基于该技术添加荧光探针，并使用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终利用标准曲线对模板进行定量分析。近年来，使用实时荧光定量PCR技术来探寻环境中抗性基因的变化的研究越来越多。此外，由于该方法不依赖微生物培养，因此也可以检测传统培养法不可培养微生物所携带的抗性基因，从而使最终的定量结果更加的全面可靠^[13]。目前，基于SYBR Green荧光染料的定量PCR方法被广泛使用，其灵敏度、易于使用且成本低，已被用于如土壤、水环境、沉积物等多种环境介质中的ARGs的定量。然而，SYBR Green特异性较差，可能与引物二聚体或者非特异性产物结合，产生假阳性信号，有需要的时候可以采用凝胶电泳法来检验是否有此类干扰的产生。此外，基于TaqMan荧光探针的定量PCR方法也是常用的方法，例如进行废水处理系统，天然水和农业生态系统中ARGs的量化^[3]。

1.5 研究内容与目标

1.5.1研究目标

评估饮用水源中抗生素抗性基因的污染情况，有助于确保饮用水的质量。磺胺类药物是最早被广泛使用的一类化疗药物，而且目前在湖北地区长江流域以及汉江流域有较多的检出。本研究通过对水处理各个阶段的出水进行磺胺类抗性基因检测，并通过对检测方法进行特异性确认以此来分析各个不同的处理阶段对抗性基因处理效果。通过分析并得出结论，来帮助厂家更好的把控各个阶段对抗性基因的去除，并对不足的阶段做出提示，推进水处理技术更好的发展。

1.5.2研究内容

本课题以水处理过程中的原水、沉淀池出水、砂滤池出水、深度处理出水、出厂水作为样品，通过对其进行DNA提取，并用超微量分光光度计进行纯度和浓度的测定。再采用qPCR仪器对磺胺类抗性基因sul1、sul2以及16SrRNA进行检测，以此来分析这五个样品中抗性基因的浓度变化情况，研究不同的处理方法对抗性基因浓度的影响情况。主要的研究内容如下：