摘 要

5-羟甲基糠醛（HMF）作为一种重要的生物质来源的平台化合物，在精细化学品、生物材料合成中有着重要的应用。近年来生物催化转化HMF因具有对环境友好、所需反应条件温和以及对底物选择性高等优点，渐渐受到人们的关注。本研究以HMF为底物试图从被化工厂污染过的土壤中筛选能够高效、高选择性转化降解HMF的微生物菌株。初步筛选结果显示，从12种不同来源的土壤样品中分离得到20株快速转化高浓度HMF的微生物纯培养物。并且分离得到的微生物纯培养物能够耐受高浓度HMF，其中有2株性能优异，产物选择性强。

关键词：生物催化 5-羟甲基糠醛（HMF） 全细胞催化

ABSTRACT

5-hydroxymethylfurfural (HMF), as an important platform material for biomass sources, has important applications in the synthesis of fine chemicals and biomaterials. In recent years, biocatalytic HMF has been favored by people because of its environmental friendliness, high selectivity and mild reaction conditions. In this study, HMF was used as a substrate to try to screen microbial strains that could be efficiently and selectively converted to degrade HMF from soils contaminated by chemical plants. The preliminary screening results showed that 20 strains of microbial pure cultures that rapidly converted high concentrations of HMF were isolated from soil samples from 12 different sources. And the isolated microbial pure culture can tolerate high concentration of HMF, of which 2 strains have excellent performance and product selectivity is strong.

Key words: biocatalysis; 5-hydroxymethylfurfural (HMF); whole cell catalysis

目录

摘要 I

ABSTRACT II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 5-羟甲基糠醛的性质与利用 1

1.2.1 5-羟甲基糠醛的性质 1

1.2.2 化学方法制备5-羟甲基糠醛 1

1.2.3 由木质纤维素生物质生产5-羟甲基糠醛 2

1.2.4 羟甲基糠醛衍生物及利用 2

1.3 生物催化转化意义和应用 3

1.3.1 简介 3

1.3.2 意义 4

1.3.3 应用 4

1.4 5-羟甲基糠醛的生物催化氧化 4

1.4.1 5-羟甲基糠醛的全细胞催化氧化 5

1.4.2 5-羟甲基糠醛的酶法催化氧化 6

1.5 本课题的目的和意义 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验所需 7

2.2实验步骤 9

2.2.1 配置LB培养基 9

2.2.2 土样处理及初步筛选 9

2.2.3 生长细胞反应 10

2.2.4 静息细胞反应 10

2.2.5 配置5-羟甲基糠醛底物及产物标准品 11

2.2.6 处理样品 11

2.2.7 高效液相色谱检测仪（HPLC）的样品检测 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 液相色谱图 12

3.2 实验结果 15

3.3 讨论 18

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 前言

随着化石资源的枯竭和日益严峻的环境问题，以可再生的生物质为原料生产人类所需的化学品和生物燃料越来越受到重视。生物质作为一种地球上存在的最广泛的可持续性资源，所需成本低，能够被生物降解且可循环再生，故而将其转化成平台化合物和大宗化学品是一个重要发展方向。木质纤维素就是其中最丰富的生物质资源，用来制备生物能源和生物基平台化合物最为理想。5-羟甲基糠醛（HMF）具有广阔的应用前景，被视为最具价值和潜力替代石化工业中基础化学品的生物基平台化合物，因其结构特性可制备多种高附加值中间体，在合成高附加值的精细化学品和生物基高分子聚合物等方面具有广泛的经济和社会意义。

当前，化学催化依然是HMF高值化转化的主要方法，因其具有催化剂对环境不友好、选择性不理想、易产生大量副产物从而影响实验精确度等问题，使得相比之下具有明显优势的生物催化方法渐渐成为未来发展的方向。

1.2 5-羟甲基糠醛的性质与利用

1.2.1 5-羟甲基糠醛的性质

5-羟甲基糠醛（HMF）的理化性质如图1-2-1所示：

图1-2-1 HMF的理化性质

HMF分子的呋喃环上含有一个醛基和羟甲基，具有优良的反应性能，通过催化氧化等反应可以制备一系列在工业生产中具有重要应用价值的化学衍生物和新型高分子材料，应用价值十分广泛，具有良好的市场前景。

1.2.2 化学方法制备5-羟甲基糠醛

王军对羟甲基糠醛的化学制备方法进行了详细的总结，根据反应溶剂系统的不同主要分为两种：一是单相法，在单纯水相或有机相中生成羟甲基糠醛；二是双相法，有机相和水相形成互不相溶的反应系统，在水相中形成羟甲基糠醛，同时反应过程中5-羟甲基糠醛（HMF）不断地被萃取到有机相中，此外，还有采用超临界流体、亚临界水/二氧化碳和离子液体反应体系制备HMF[1]。

秦烨芝[2]和徐杰则从果糖、葡萄糖、纤维素等碳水化合物催化脱水制备HMF方面进行了概述：果糖通过脱水转化制备HMF相对较为容易；葡萄糖脱水制HMF的关键步骤为异构化，应用研究还面临着许多挑战；纤维素转化制HMF的关键是实现原料的溶解和解聚，多年来，酸催化果糖、葡萄糖和纤维素等碳水化合物脱水制备HMF的过程、催化体系和反应介质的过程仍大多停留在研究阶段，缺少成熟的工业应用和生产技术[3]。

1.2.3 由木质纤维素生物质生产5-羟甲基糠醛

许多化学品和石化产品的结构之间最大的差异之一是前者中杂原子的普遍存在以及后者中缺乏杂原子，而许多商品化学品和几乎所有特种化学品和药品都含有一种或多种杂原子，但将含有氧、氮、硫或磷的官能团引入原油衍生化学品往往是一项非常耗能的工作。随着化石资源的日益消耗伴随全球气候环境变化问题，推动了人们对可再生能源和可再生资源方面利用的关注。Max J[4]提到未来开发生产带有杂原子的化合物也许是解决化石资源枯竭的方法之一，尤其是由木质素生产酚类化合物。木质纤维素生物质被认为是化石的替代碳源，可用作制备液体燃料和有价值化学品的原料。在替代石油资源，同时寻求化学工业的环保替代品方面，Werpy等[5]提出了生物精炼厂这一概念，其在生产生物原料、化学品和燃料方面发挥着核心作用。生物精炼厂的相关途径是使用木质纤维素残余物作为原料，通常需要建立预处理步骤以改变木质纤维素网络。预处理可以使木质纤维素的主要成分（半纤维素，木质素和纤维素纸浆）用于进一步化学升级[6]，比如由木质纤维素生物质生产的5-羟甲基糠醛（HMF）就可以催化升级为有价值的化学品和燃料，Xiaoyun Li[7]就提到其重点是木质纤维素生物质的预处理，Haiyong Wang[8]也对木质纤维素生物质催化转化为5-羟甲基糠醛的最新进展进行了概述。木质纤维素生物质制成的HMF已然成为最吸引人的平台化学品之一。

1.2.4 羟甲基糠醛衍生物及利用

5-羟甲基糠醛的还原产物2，5-呋喃二甲醇（BHMF）可作为一些生物基聚合物或冠醚的原料化合物，具有广泛应用。2,5-呋喃二甲醛（FDC）具有醛的典型化学性质，可用于合成许多新化合物[1]。HMF生物氧化的下游产物众多，其中，2,5-呋喃二甲酸（FDCA）因具有替代石油基大宗化学品对苯二甲酸的潜力，而成为HMF生物催化氧化的研究重点，它还可以作为合成聚酯类材料的初始原料。此外，李宁[9]对生物催化氧化HMF合成其衍生物DFF、HMFCA、FFCA、FDCA等的相关过程也进行了总结。

1.3 生物催化转化意义和应用

1.3.1 简介

生物催化是指利用酶或者生物有机体（全细胞、细胞器、组织等）作为催化剂进行化学转化的过程，又被称为生物转化[10]。利用微生物胞内的酶催化促进生物转化的进程是生物催化转化的一大本质。正因酶催化和多酶合成途径的特性之强大，天然产物分子结构和功能的多样性才可能存在于自然环境中。

生物催化转化具有许多独特的特征。首先，生物催化转化一般在温和的条件下就可以发生反应，大都在常温常压、中性、水溶液等环境中就可以完成，而不像部分化学催化过程，需要高温高压等极端环境，因此更适用于那些对温度、pH等条件敏感的物质进行反应；其次，生物催化的底物选择性极高，这是因为反应中的酶具有高度专一性，只催化一种特定的底物或反应，而一种底物却可能被多种不同的酶催化；此外，生物催化转化还具有高效性，对于手性活性药物成分的合成具有独特的优点，且这种转化成本低廉，污染少，对环境友好，适应可持续发展的要求。

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