1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述 l-苹果酸是自然界中广泛存在的一种天然有机酸，也是tca 循环中的重要一员，在食品、医药和化工等领域应用广泛[1], 具有良好的市场前景。

其生产方法[2]主要有化学合成法、酶催化法和微生物发酵法，其中微生物发酵法因其原料来源广、成本低、工艺条件温和、产品质量稳定以及生产方式绿色环保等优势，被认为是最有前景的一种生产方式，因此成为近年来的研究热点。

battat等首次发现黄曲霉（aspergillus f lavus）可以利用糖质原料直接发酵生产l-苹果酸，并对其发酵条件进行优化后， l-苹果酸产量达到113 g/l，产率达到1.26 mol/mol葡萄糖[3]。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1、主要研究内容 （1）构建nadc基因缺失菌株和鉴定 利用crispr/cas9技术,在大肠杆菌afp111中敲除关键基因nadc，从而考察改造菌株的溢出能力是否受到影响。

（2）利用重组大肠杆菌进行三阶段发酵产l-苹果酸。

重组大肠杆菌在第一阶段有氧生长菌体，接着转入第二阶段厌氧产丁二酸，待葡萄糖耗尽再转为第三阶段有氧转化，将丁二酸、乙酸等作为碳源生产l-苹果酸。