1. 研究目的与意义（文献综述）

蛋白质的错误折叠和聚集是蛋白质稳定性研究中的重点。目前已有二十多种疾病被证明与蛋白质纤维化有关，如阿尔兹海默病、疯牛病、帕金森氏病及Ⅱ型糖尿病等。蛋白质在一定的条件下可产生淀粉样变性形成纤维，沉积于细胞膜，造成细胞损害，最终导致细胞凋亡[1] 。不同蛋白质淀粉样纤维在显微结构上十分相似，都富含β－折叠结构，具有较强的表面疏水性和一定诱导氧化胁迫的作用。蛋白质淀粉样纤维的这些性质与其细胞毒性密切相关。已有的研究证实，抑制蛋白质淀粉样纤维化，溶解或者破坏淀粉样纤维结构可能是治疗相关疾病的有效途径。另一方面，蛋白质的纤维化除了与疾病本身有着密切联系，还影响着蛋白质药物制品的安全性和稳定性，比如对于需要用到胰岛素注射的糖尿病患者，在反复注射部位通常会出现注射淀粉样变，也就是由蛋白质纤维化引起的细胞外的淀粉样沉积 ^[2-4]。因此研究筛选具有抑制蛋白质纤维化作用的药物具有重要意义。

胰岛素是一种用于治疗糖尿病的蛋白质激素，是由 51 个氨基酸残基组成的多肽, 极易形成淀粉样纤维, 通常将其作为研究多肽淀粉样纤维化、 筛选抗纤维化药物以及纤维细胞毒性分子机制的模型分子^[5]。胰岛素主要是呈 α -螺旋结构，而当其发生纤维化，结构会发生变化，从而富含β折叠结构。这种变化可以由对β折叠结构敏感的染料如硫黄素t和刚果红等进行检测^[6-9]。胰岛素的纤维化会影响到其保存、运输时的稳定性以及使用时的安全性，还会使得酸性条件下，胰岛素的分离和纯化难度加大^[10]。因此抑制其纤维化，是解决这一系列问题的主要方式之一。

已有研究显示，天然有机分子在抑制蛋白质纤维化过程中扮演着重要的角色。李红红 ^[11] 发现谷胱甘肽能够抑制胰岛素的淀粉样纤维化和降低形成的纤维聚集体的表面疏水性 ，并降低胰岛素纤维对细胞的损害作用 ；严向阳^[12] 研究了银杏叶提取物egb761对胰岛素纤维化的作用，确认egb761能够抑制淀粉样纤维的形成，使纤维形态改变，并能够抑制淀粉样纤维诱导的红细胞聚集和溶血；kachooei e^[13]的研究显示天然提取物紫杉醇能够显著地阻碍成核，从而抑制胰岛素的纤维化，且这一过程与剂量密切相关；lobbens e s, foderà v^[14]通过芦荟素与胰岛素的相互作用研究得出天然提取物对蛋白质纤维化的抑制作用是源于其降解产物而非提取物本身。天然提取物对蛋白质纤维化的抑制作用与其疏水性和抗氧化作用密切相关^[15]。同时，天然提取物具有来源广，成分安全等优点，研究不同提取物对纤维化作用的影响对于药物制备合成具有重要意义，也能对蛋白质稳定剂提供新的选择。

2. 研究的基本内容与方案

2.1 基本内容

实验过程：设置对照实验，以胰岛素为研究对象，将未添加植物提取物的胰岛素纤维化培养过程作为对照，分别以不同天然植物提取物（菊苣酸、黄芩素、黄芪甲苷、环黄芪醇）为变量与胰岛素共培养，探究这些植物提取物对于胰岛素纤维化过程的影响。实验过程中使用酶标仪用tht染料标记监测动力学过程，用圆二色谱仪（cd）监测胰岛素二级结构的变化。

结果表征：使用原子力显微镜（afm）、石英晶体微天平（qcm）、动态光散射（dls）分别对共培养之前以及与不同植物提取物共培养之后的胰岛素进行表征，确定胰岛素结构、表面状态和形貌、粒径。分析酶标仪以及cd所得到的监测数据，确定胰岛素纤维化过程是否被影响。

3. 研究计划与安排

第1－5周：查阅相关文献资料，完成英文翻译。明确研究内容，了解研究所需原料、仪器和设备。确定技术方案，并完成开题报告。

第6－9周：按照设计方案，用酶标仪分别对胰岛素单独纤维化和不同植物提取物与胰岛素的共培养生长进行研究。

第10－14周：采用cd、qcm、afm、dls等测试技术对培养后的胰岛素蛋白的二级结构、粒径、形貌等进行测试。

4. 参考文献（12篇以上）

1. 田建庭, 李文涓, 曾成鸣. 槲皮素对淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用[j]. 西北药学杂志, 2012, 27(5):444-447.

2. shikama y, kitazawa ji, yagihashi n, uehara o,murata y, yajima n, et al. localized amyloidosis atthe site of repeated insulininjection in a diabetic patient. internal med. 2010; 49(5):397–401.

3. dobson cm. protein .misfolding, evolution anddisease. trends in biochem sci. 1999; 24(9):329–32.