1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1.乳酸菌简介

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）指能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，为原核生物。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，目前至少可分为18个属，共有200多种，其中乳杆菌属种类最多，且在国家明文规定的食品菌中的所占比重最大。乳酸菌是兼性厌氧菌，能在低氧或无氧的环境生长，其最适生长温度在30℃~40℃，最适pH值为5.5~6.2，但其生长所需营养条件较高，除了需要碳源、氮源、各种无机盐还需要各种促生长因子。乳酸菌除极少数外，绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。

乳酸菌在乳制品，肉类和蔬菜加工方面有着广泛的应用，特别是在干酪和酸乳等发酵乳制品的生产。乳酸菌的发酵过程可以分解蛋白质、糖、脂质,并把人体难吸收的乳糖降解为乳酸和乙酸，便于人体吸收利用，可合成各种人体无法自身合成的营养物质，如抗菌肽、活性酶、维生素，多糖等。

2.乳酸菌胞外多糖

2.1乳酸菌胞外多糖简介及应用

乳酸菌（LAB）胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）指在生长、代谢过程中乳酸菌分泌到细胞壁外常渗于培养基的黏液多糖（Slime polysaccharide，SPS）或荚膜多糖（Capsularpolysaccharides，CPS）的总称[1]。LAB的EPS不仅具有重要的物理化学特性，如良好的流变学特性，可作增稠剂、乳化剂、稳定剂、填充剂、胶凝剂和持水剂应用到医药、食品、石油化工以及生化产品等领域[2]，还具有良好的生物活性，如保护菌体[3]、促进菌体黏附[4]、降胆固醇[5]，抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、抗病毒[8]、调节肠道菌群改善肠道微生态环境[9]和增强人体免疫力[10]等。

由于LAB的EPS的产量较低，如何能提高其产量成为研究热点。国外学者对影响其产量的因素做了大量研究，从分子水平上对产EPS的酶以及基因的调控和表达因子作了大量的探索，并取得一定成果。国内近年来在该领域开始有一些研究，但仍需加大研究力度。

2.2乳酸菌胞外多糖类型

根据组多糖的单糖种类不同，LAB的EPS可分为两大类：由同一种单糖聚合而成的同型多糖（Homopolysaccharide，HoPS）和由不同的单糖及其衍生物和取代单糖组成的异型多糖（Heteropolysaccharide，HePS）。

HoPS大多以葡萄糖或果糖为单糖，分别组成葡聚糖和果聚糖。根据糖苷键的不同类型，大致分为四类如下表：

表1 同型多糖的类型

Tab. 1 types of HoPS

乳杆菌HePS产量较少，一般为每升几百毫克，结构较HoPS更为复杂[16]。异型多糖的生物合成是在细胞质中进行，其重复单元的组成成分有单糖、单糖衍生物和取代单糖，常见的单糖有D-半乳糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖，有时也会出现D-甘露糖，D-木糖和D-阿拉伯糖等其他己糖和戊糖。少数还存在N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）、N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）和葡糖醛酸（Glucuronic acid，GlcA）[17]，有时在这些非糖残基中还可能存在其它基团如磷酸基、乙酰基、丙酮酸盐和甘油等[18]。

3.乳酸菌胞外多糖的生物学活性

3.1抗肿瘤作用

乳酸菌胞外多糖发挥抗肿瘤作用的机制是多途径的：a.增强宿主免疫功能从而发挥抗肿瘤作用,多糖通过激活巨噬细胞、网状内皮系统、T淋巴细胞和B淋巴细胞、补体及促进干扰素(INF)、白细胞介素等多种细胞因子的生成等途径而对机体免疫功能产生影响。b.某些多糖具有细胞毒性,可直接杀死肿瘤细胞,如茯苓多糖、刺五加多糖、银耳多糖等。c.促肿瘤细胞凋亡作用。d.通过抑制肿瘤细胞周期,影响血液供应等起到抗肿瘤作用。

3.2免疫调节作用

LAB的EPS的免疫调节功能是通过增强细胞介导的免疫反应，如促进T/B淋巴细胞增殖、激活NK细胞杀伤肿瘤细胞、提高单核细胞吞噬能力、促有丝分裂、释放细胞因子，从而增强宿主的免疫防护作用[19]。

3.3对消化道功能的调节作用

3.3.1促进菌体在肠粘膜上的粘附作用

EPS可以提高菌株对肠道表面的非特异性粘附能力。荚膜多糖可以促进菌体在肠粘膜表面的粘附,使菌体更易在肠道内定植。

3.3.2对结肠癌的防治作用

一些肠道内微生物可使其降解,产生短链脂肪酸,被肠粘膜上皮细胞吸收。其中丁酸可调节结肠糖苷的生成和定位,刺激将要产生癌变的细胞的免疫能力,诱导肿瘤细胞向正常细胞转化,并控制致癌基因的表达,因而对防治结肠癌起到了关键的作用[20]。

3.4对细胞体的保护作用

荚膜多糖和粘液多糖的生理功能主要起防护作用,可形成亲水表面防止细胞干裂、螯合重金属离子防止其毒害、使噬菌体不敏感从而防止其侵害、防止抗生素破坏细胞(抗生素必须在胞外多糖中达到饱和才能到达细胞壁)、提供高氧张力等。

3.5益生作用

由L.sakeiO-1和L.helveticus Lh59产生的食品级EPSs能够耐受人结肠腔环境中酶的压力，L.platarum A3产生的EPS具有良好的耐受胃酸和胰消化酶的能力[21]。当EPS到达人体肠道后，可作为碳源被肠道中其他有益菌所利用，促进有益菌的定殖和生长，对机体产生健康的作用[22]。

3.6抗氧化作用

LAB的EPS抗氧化主要是通过在体外实验中对清除自由基、抑制脂质过氧化作用、抑制亚油酸氧化等指标检测。Ye[23]等体外研究了Pseudomonas PF-6产的酸性多糖对DPPH自由基、羟自由基和超氧自由基均有较强的清除作用，且多糖对-OH的清除能力强于Vc，清除O2-的能力与Vc相当，显示出较强的抗氧化能力。可能的作用机理，一是多糖分子直接作用于自由基本身，直接捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，从而减少反应链的长度，阻止或缓解脂质过氧化的进行；二是多糖分子螯合催化活性氧自由基（ROS)产生的金属离子；三是多糖分子可提高体内抗氧化酶系活力，从而发挥作用[24]。

4.乳酸菌胞外多糖的分离纯化

LAB的EPS的分离纯化是解析EPS结构和评价生物活性的前提基础，一般而言，EPS分离纯化的主要步骤是发酵液离心法去除凝结酪蛋白和菌体，三氯乙酸法除去未凝结蛋白，无蛋白的发酵液经乙醇一次性沉淀EPS去除色素，冷松干燥得粗多糖。粗多糖大多是多种多糖的混合物，因此需要用适当的方法对粗多糖进行进一步的分离纯化，将混合单糖分离成单一多糖，应用比较广泛的是柱层析法。最后经纯化后的多糖需要对其纯度进行鉴定。常见的乳酸菌胞外多糖纯化流程如下图：

图1.乳酸菌胞外多糖纯化流程图

Fig. Purification process of extracellular polysaccharide from lactic acid bacteria

5.乳酸菌胞外多糖的结构分析

多糖的结构复杂，一般指其一级序列结构和高级空间结构，一级结构指单糖残基的种类、单糖残基间的连接顺序、糖苷键构型、连接方式、分子量和取代基种类及数量等；高级结构即空间构型，包含二、三、四级结构；二级结构指多糖骨架链间以氢键结合形成的各种空间构象（例α-螺旋，β-折叠，无规卷曲）；三级结构是在二级结构的基础上，由于分子内羟基、羧基、氨基等基团间的非共价键作用，致使二级结构形成规则的粗大构象；四级结构指不同糖链间以非共价键结合形成的共聚体。

虽然测定多糖的结构相对比较困难，但是对多糖结构的解析，对明确其生物活性有重要意义。常用的多糖结构分析如下表：

表2 多糖结构分析中常用的技术方法

Table 2. Commonly used methods of determination of sugar chain structure

6.研究目的与意义

许多疾病都来源于自由基的积累和氧化损伤，而食源抗氧化剂的摄入有助于改善机体氧化防御系统，维持组织细胞内的氧化平衡，预防氧化应激相关疾病，人民对抗氧化食品的关注日益提高，因而，寻找安全的抗氧化活性物品是当下备受关注的一个话题。乳酸菌EPS作为天然来源抗氧化剂有着得天独厚的优势，因为乳酸菌是公认安全食品级微生物，其所产生的EPS也被认为是公认的安全的食品添加剂，符合绿色健康的理念。LAB的EPS可以直接产生于发酵食品体系中，还可发挥食品添加剂的作用，其重要的生活学活性进一步提高了产品的营养保健价值。同时，LAB的EPS具有不为消化道淀粉酶所消化的特性，可以活性形式存在于体内不被降解。LAB EPS往往具有独特的生物活性，但目前对其结构和功能的关系尚无统一的说法[25]。因而LAB的EPS的分离纯化、结构分析及抗氧化性的研究与其他多糖相比更具理论价值和实际意义[26]。

参考文献

[1] Ramchandran L, Shah N P. Effect of exopolysaccharides on the proteolytic and angiotensin-I converting enzyme-inhibitory activities and textural and rheological properties of low-fat yogurt during refrigerated storage[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(3):895-906.during refrigerated storage[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(3): 895-906.

[2] 马静. 乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究[D].河北：河北农业大学，2004.

[3] Ophir T, Gutnick D L. A role for exopolysaccharides in the protection of microorganisms from desiccation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(2): 740-745.

[4] Ruas-Madiedo P, Gueimonde M, Margolles A, et al. Exopolysaccharides produced by probiotic strains modify the adhesion of probiotics and enteropathogens to human intestinal mucus[J].Journal of Food Protectionreg;, 2006, 69(8): 2011-2015.

[5] Welman A D, Maddox I S. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges[J]. Trends in biotechnology, 2003, 21(6): 269-274.

[6] Liu C F, Tseng K C, Chiang S S, et al. Immunomodulatory and antioxidant potential of Lactobacillus exopolysaccharides[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(12): 2284-2291.

[7] Wang K, Li W, Rui X, et al. Characterization of a novel exopolysaccharide with antitumor activity from Lactobacillus plantarum 70810[J]. International journal of biological macromolecules, 2014, 63: 133-139.

[8] Arena A, Maugeri T L, Pavone B, et al. Antiviral and immunoregulatory effect of a novel exopolysaccharide from a marine thermotolerant Bacillus licheniformis[J]. International immunopharmacology, 2006, 6(1): 8-13.

[9] Hongisto S, Paajanen L, Saxelin M, et al. A combination of fibre-rich rye bread and yoghurt containing Lactobacillus GG improves bowel function in women with self-reported constipation[J]. European journal of clinical nutrition, 2006, 60(3): 319-324.

[10] Vinderola G, Perdig#243;n G, Duarte J, et al. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity[J].Cytokine, 2006, 36(5): 254-260.

[11] van Leeuwen S S, Kralj S, van Geel-Schutten I H, et al. Structural analysis of the α-D-glucan (EPS180) produced by the Lactobacillus reuteri strain 180 glucansucrase GTF180 enzyme[J]. Carbohydrate research, 2008, 343(7): 1237-1250.

[12] Ozimek L K, Kralj S, Van der Maarel M J, et al. The levansucrase and inulosucrase enzymes of Lactobacillus reuteri 121 catalyse processive and non-processive transglycosylation reactions[J]. Microbiology, 2006, 152(4): 1187-1196.

[13] Anwar M A, Kralj S, van der Maarel M J, et al. The probiotic Lactobacillus johnsonii NCC 533 produces high-molecular-mass inulin from sucrose by using an inulosucrase enzyme[J].Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(11): 3426-3433.

[14] Duentilde;as-Chasco M T, Rodr#305;#769; guez-Carvajal MA, Tejero-Mateo P, et al. Structural analysis of the exopolysaccharides produced by Lactobacillus spp. G-77[J]. Carbohydrate research, 1998,307(1): 125-133.

[15]Monsan P, Bozonnet S, Albenne C, et al. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9):675-685.

[16]Tallon R, Bressollier P, Urdaci M C. Isolation and characterization of two exopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum EP56[J]. Research in Microbiology, 2003, 154(10):705-712.

[17]田政, 王辑, 郑喆,等. 乳酸菌胞外多糖的结构及功能特性研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2013(3).

[18]旭日花, 李平兰. 乳酸菌胞外多糖研究新进展[J]. 中国乳品工业, 2009, 37(12):41-45.

[19]邵丽. 产胞外多糖乳杆菌的筛选及其多糖的分离、结构和生物活性研究[D].江南大学,2015.

[20]张筠,刘宁,孟祥晨. 乳酸菌胞外多糖的生物学活性[J]. 国外医学(卫生学分册),2004,04:227-230.

[21]王辑. 产胞外多糖植物乳杆菌的分离筛选、分子表征及其应用研究[D].吉林大学,2015.

[22] Hongpattarakere T,Cherntong N,Wichienchot S,et al.In vitro prebiotic evaluation of exopolysaccharides produced by marine isolated lactic acid bacteria[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(1):846-852.

[23] Ye S,Liu F,Wang J,et al.Antioxidant activities of an exopolysaccharides by Lactobacillus and Bifidobacterium strains of human origin,and metabolic activity of the producing bacteria in milk[J].Journal of diary science,2009,92(9):4158-4168.

[24] 俞慧红，竺巧玲，戴飞，等.多糖抗氧化作用的研究现状[J].食品研究与开发，2008，172-176.

[25]冯美琴. 植物乳杆菌胞外多糖发酵、结构鉴定及其功能特性研究[D].南京农业大学,2012.

[26]李景艳. 乳酸菌胞外多糖的抗氧化活性及其结构[D].江南大学,2013.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案