1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述

1.1异麦芽酮糖的重要用途

异麦芽酮糖（6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，Isomaltulose），又名帕拉金糖（Palatinose），它是葡萄糖和果糖以α-1,6糖苷键结合形成的双糖^[1]。它与蔗糖仅在分子内果糖与葡萄糖的连接部位不同，所以它是蔗糖的同分异构体^[2]。异麦芽酮糖呈白色结晶，没有异味，熔点124 #176;C，分子量为342.32，比旋光度[α]₀²⁰为97.2，结构式如下：

图 1-1 异麦芽酮糖结构式

异麦芽酮糖存在于蜂蜜中，是一种还原糖，故具有与蔗糖类似的物理性质和口感，甜度大约为蔗糖的52%；它在水中的溶解度也比蔗糖低。但不同的是，异麦芽酮糖极耐酸解，若将异麦芽酮糖和蔗糖在酸性条件下，加热至100 #176;C，保持1 h，蔗糖全部水解为果糖和葡萄糖，而异麦芽酮糖并未酸解。由于大多数细菌、霉菌、酵母都不能利用异麦芽酮糖，因此它的防龋齿效果显著。正因为这些独特的性能，异麦芽酮糖便可以制取无糖食品，这受到了食品界的广泛欢迎。首先，异麦芽酮糖是一种适合生长发育中需要糖的婴儿及青少年食用的不致龋齿的甜味剂。日本营养食品协会规定，凡在食品中使用异麦芽酮糖 70%以上的，即可表明该食品为不产生龋齿的食品^[3]。同时，异麦芽酮糖在小肠中能被一种复合酶分解为葡萄糖和果糖，缓慢吸收进入代谢^[4]，并可使血糖稳定在一定的水平，由于吸收缓慢，胰岛素水平变化不大，所以糖尿病人可食用；其次，因为异麦芽酮糖具有很低的吸湿性，不会像普通糖果一样变粘，可以被松散地包装，稳定性强，这是麦芽糖醇和木糖醇等功能糖醇难以实现的。异麦芽酮糖还是制造止咳糖和润喉糖一类的最佳选择，低溶解度使它在口中能够减慢活性成分的释放，来延长发挥效用时间。异麦芽酮糖被市场认可的另一主要优点是口味纯正，它几乎可以替代蔗糖的任何用途，消费者很难分辨出其与有糖食品的区别，这样便使无糖食品”美味不打折”。因

此，异麦芽酮糖成为目前最受欢迎的蔗糖替代品。近年全球销售总量稳步增长，目前市场上已有的异麦芽酮糖食品有糖果、巧克力、口香糖、冰淇淋、果仁软糖、果冻、糕点涂抹食品、餐桌甜味剂等。

1.2异麦芽酮糖的研究现状

目前，异麦芽酮糖的生产普遍通过蔗糖异构酶(EC 5.4.99.11,Sucrose isomerase，SIase)催化底物蔗糖而进行。部分菌株已被应用到异麦芽酮糖的工业化生产中。主要的生产方法有固定化细胞转化、酶转化法和游离细胞转化三种方法。

异麦芽酮糖能够通过催化加氢还原成异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖醇具有低甜度、不致龋齿、不吸湿、耐酸解、酵母及一些微生物不能利用、糖尿病人可食用、风味类似蔗糖等性质。因此，凡使用蔗糖作为甜味剂的食品、饮料、冷冻食品等均可以部分或全部用异麦芽酮糖及其糖醇取代^[5, ^6]。

在化学工业中的应用：异麦芽酮糖是合成表面活性剂和多聚物的原材料。目前，蔗糖的世界年产量达1.1 亿吨，是世界上最高产的可再生有机复合物，但因其糖链间的不稳定性和缺乏特异化学反应性，利用蔗糖作为化学原材料受到很大的限制，而异麦芽酮糖是蔗糖的还原性异构体，能被特异性氧化并衍生成不同的化学产品。

1.3蔗糖异构酶的来源和生产

1.3.1蔗糖异构酶的来源

SIase的主要来源是细菌^[7]。沙雷氏杆菌(Serratia plymuthica)、嗜中酸假单胞菌（Pseudomonas mesoacidophila）、放射性土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）、多源发散菌(Pantoeadispersa)、红色精朊杆菌（Protaminobacter rubrum）、肠杆菌属(Enterobactersp.)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella sp.)以及大黄欧文菌（Erwinia rhapontici）等均具有SIase的合成能力，根据酶催化主产物的种类分为异麦芽酮糖主产 型（70-85%），如P. rubrum CBS547.77、E. rhapontici NX-5 、S. plymuthica ATCC15928 、K. sp.LX-3等，海藻 酮糖主产型（85-95%），如P. mesoacidophila MX-45、A. radiobacter MX-232。

1.3.2蔗糖异构酶的生产

培养条件和培养基的组成是影响蔗糖异构酶生产的主要因素，Huang等^[8]在利用K. planticola CCRC 19112催化蔗糖生成异麦芽酮糖的过程中，对培养基进行了优化，优化后的培养基中主要含果糖、胰蛋白胨溶液和蔗糖。Kawaguti等^[9]以廉价糖蜜作为碳源，

利用中心复合设计实验对Erwinia sp. D12的产酶培养基进行优化，以玉米浆、糖蜜、酵母膏为主要成分，Erwiniasp. D12的产酶水平最高可达10.84 U/mL。Li等以酵母膏、蛋白胨为主要成 分培养K. sp. LX-3，酶活可达15.12U/mL。尽管对发酵产酶培养基进行优化，蔗糖异构酶的活力有了一定程度的提高，但是细胞产量普遍较低，这导致了在实际生物合成异麦芽酮糖的过程中，细胞用量巨大的问题仍然存在。

1.4蔗糖异构酶的纯化与酶学性质

1984年，Cheetham在Nature上发表用细胞转化蔗糖生产异麦芽酮糖，并从中分离得到较纯的SIase，首次提出异麦芽酮糖的合成与SIase有关，该酶对蔗糖具有非常严格的底物特异性。此后通过离子交换色谱和亲和色谱等各种分离纯化手段，不同来源的SIase得到了分离纯化，其生化性质也得到了具体的研究。

大多数SIase均来源于微生物^[10]，如表1-1所示其最适反应温度均处在20-40 #176;C之间。反应温度是生物催化反应中一个非常重要的参数，蔗糖异构化的产物分布受反应温度影响较大，但不改变糖最终的生成量。低温条件有利于生成海藻酮糖，而较高的温度有利于异麦芽酮糖的生成，例如P. mesoacidophila MX-45的最适反应温度为20 #176;C；而Erwinia sp. D12 和K. sp. LX-3的最适反应温度分别为40 #176;C和 35 #176;C。一般来说，反应温度越高，反应速度越快，但高温条件（50 #176;C以上）蔗糖的水解反应明显加剧，使蔗糖水解生成大量的葡萄糖和果糖。SIase的最适pH处于5.5-7.0之间，zhang等报道了催化反应的最终产物与催化口袋表面的电荷性质相关，当反应pH高于最适pH时，海藻酮糖将大量生成；反之则蔗糖水解加剧，果糖与葡萄糖的量有所增加。不同来源的蔗糖异构酶的动力学常数如表1-1所示，不同SIase对蔗糖的亲和力表明：酶对底物的识别能力是不尽相同的，如来源于E. rhapontici NCPPB 1578中的蔗糖异构酶K_m值是P. mesoacidophila MX-45 中蔗糖异构酶 K_m值的14.7倍。微生物来源的蔗糖异构酶由单亚基组成，分子量一般处于60-70 kDa之间。P. dispersa UQ68J的蔗糖异构酶分子量为40 kD，而S. plymuthica ATCC15928中蔗糖异构酶分子量为79.5 kD。

表1-1 不同来源的SIase及其相关生物化学性质

参考文献：

[1]. Lee, G.Y., et al., Isomaltulose production via yeast surface display of sucrose isomerase from Enterobacter sp. FMB-1 on Saccharomyces cerevisiae. Bioresour Technol, 2011. 102(19): p. 9179-84.

[2]. Wu, L., et al., An innovative method for immobilizing sucrose isomerase on epsilon-poly-L-lysine modified mesoporous TiO₂. FOOD CHEMISTRY, 2015. 187: p. 182-188.

[3]. Krastanov, A. and T. Yoshida, Production of palatinose using Serratia plymuthica cells immobilized in chitosan. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003. 30(10): p. 593-8.

[4]. Bornke, F., M. Hajirezaei and U. Sonnewald, Cloning and characterization of the gene cluster for palatinose metabolism from the phytopathogenic bacterium Erwinia rhapontici. J Bacteriol, 2001. 183(8): p. 2425-30.

[5]. Lee, H.C., et al., Isomaltose production by modification of the fructose-binding site on the basis of the predicted structure of sucrose isomerase from "Protaminobacter rubrum". APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2008. 74(16): p. 5183-5194.

[6]. 林璐, 李莎与徐虹, 生物催化生产异麦芽酮糖的研究进展. 食品与发酵工业, 2007(06): 第91-95页.

[7]. Kim, Y., et al., Improved production of isomaltulose by a newly isolated mutant of Serratia sp. cells immobilized in calcium alginate. Can J Microbiol, 2015. 61(3): p. 193-9.

[8]. Huang, J.H., L.H. Hsu and Y.C. Su, Conversion of sucrose to isomaltulose by Klebsiella planticola CCRC 19112. JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY amp; BIOTECHNOLOGY, 1998. 21(1-2): p. 22-27.

[9]. Kawaguti, H.Y., E. Manrich and H.H. Sato, Production of isomaltulose using Erwinia sp. D12 cells: Culture medium optimization and cell immobilization in alginate. Biochemical Engineering Journal, 2006. 29(3): p. 270-277.

[10]. Mu, W., et al., Current studies on sucrose isomerase and biological isomaltulose production using sucrose isomerase. Appl Microbiol Biotechnol, 2014. 98(15): p. 6569-82.

[11]. Lina, B., D. Jonker and G. Kozianowski, Isomaltulose (Palatinose (R)): a review of biological and toxicological studies. FOOD AND CHEMICAL TOXICOLOGY, 2002. 40(PII S0278-6915(02)00105-910): p. 1375-1381.

[12]. Krastanov, A. and T. Yoshida, Production of palatinose using Serratia plymuthica cells immobilized in chitosan. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003. 30(10): p. 593-8.

[13]. 林璐, 李莎与徐虹, 生物催化生产异麦芽酮糖的研究进展. 食品与发酵工业, 2007(06): 第91-95页.

[14]. Aroonnual, A., et al., Role of several key residues in the catalytic activity of sucrose isomerase from Klebsiella pneumoniae NK33-98-8. Enzyme and Microbial Technology, 2007. 40(5): p. 1221-1227.

[15]. Watzlawick, H. and R. Mattes, Gene Cloning, Protein Characterization, and Alteration of Product Selectivity for the Trehalulose Hydrolase and Trehalulose Synthase from "Pseudomonas mesoacidophila" MX-45. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2009. 75(22): p. 7026-7036.

[16]. Kawaguti, H.Y., et al., Immobilization of Erwinia sp. D12 Cells in Alginate-Gelatin Matrix and Conversion of Sucrose into Isomaltulose Using Response Surface Methodology. Enzyme Res, 2011. 2011: p. 791269.

[17]. 郑婉玲, 邹云珍与臧向莹, 强化海藻酸钠凝胶制备固定化酶. 工业微生物, 1998(03): 第17-20 25页.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1本课题的研究内容，目的及意义

2.1.1研究目的与意义

研究目的：利用单因素控制变量法对产酶培养基和酶催化条件进行优化，利用蔗糖异构酶以蔗糖为底物合成高价值的异麦芽酮糖。