摘 要

丁二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，具有较大的利用价值，有着巨大的市场需求量。针对厌氧条件下利用大肠杆菌发酵产丁二酸的过程中，木糖或葡萄糖中携带的还原力不足，导致在发酵过程中NADH供给不足，进而限制了丁二酸的合成的问题。本文设计构建生物电化学系统，通过给厌氧发酵体系施加恒定电压以及添加外源性电子载体，还原态的电子载体将携带电子穿过细胞外膜进入周质空间，在此处释放电子用于胞内代谢及NADH再生，最终提高丁二酸的收率。

在验证本实验室保藏的菌种Suc260能够较好地以木糖为碳源并产出丁二酸的基础之上，考察电化学体系对丁二酸合成的影响。本实验主要研究内容和结果如下：

1. 优化外源性电子载体在厌氧发酵体系中的浓度以减少电子载体中性红对细胞的毒性并提升电子传递效率。在本实验条件下确定中性红终浓度为0.05mM有利于细胞的生长和累积丁二酸。
2. 搭建电化学系统，利用循环伏安特性曲线确定电子载体中性红氧化态和还原态之间反应电势。通过电化学工作站扫描循伏安特性曲线。当扫描电压范围-0.1-1 V，扫描速率为10 mV/s时，确定电子载体中性红的还原电势为-0.61 V。
3. 考察电化学辅助大肠杆菌Suc260木糖发酵生产丁二酸情况。对照组丁二酸收率为0.62 g/g木糖，通电组丁二酸收率为0.72 g/g，较对照组提高了16.13%。可见电化学组中大肠杆菌Suc260产酸能力有较大提升。同时，电化学组耗糖能力上升，副产物减少。
4. 考察生物电化学系统对辅酶NADH以及NAD 的影响。取发酵菌液进行预处理后，利用吸光度法测定NADH/NAD 。发现电化学组NADH/NAD 值为0.64，对照组为NADH/NAD 值0.49。细胞中还原性辅酶量提升较大，即在电化学系统以及外源性电子载体的辅助下，细胞体内NADH/NAD 发生改变，还原力增加，有利于丁二酸的合成。

关键词： 大肠杆菌，木糖代谢，丁二酸 ，生物电化学系统 ， 电子

Electrochemical stimulation of xylose utilization for succinate production by Escherichia coli SUC260

Abstract

Succinic acid is one of the key intermediates in the tricarboxylic acid cycle (TCA) and has huge potentials in biopolymer, food, medicine applications. In the progress of anaerobic fermentation, the low reducibility of xylose and glucose caused the inadequate supply of NADH , moreover ,which restricted the production of succinic acid.

Bioelectrochemical system was applied in this experiment to impose a constant voltage，and the exogenous electron carriers would make the NADH regenerate. Contents and results are as follows:

1. The concentration of exogenous electron carriers has been optimized. The proper concentration of exogenous electron carriers was 0.05mM, which would be less toxic and higher efficiency to transport electron.
2. After setting up the bioelectrocatalyze reactor, the cyclic voltammetry (CV) curve was swept from -0.1 V to -1.0 V vs Ag/AgCl at a scan rate of 5 mV/s to determine the potential applied in cathode compartment with 0.05 mM NR. Finally, the potential added in the cathode chamber was -0.61V.
3. The control group can reach the yield of 0.62 g/g xylose. However, the group under a constant voltage,-0.61 V , can reach the yield of 0.72 g/g xylose. The result is obviously improved by 16.13%.
4. NADH/NAD was investigated by absorptiometry, and the value of control group was 0.49. However the value of experimental group increased to 0.64.That is to say, with the BES and exogenous electron carriers, the reducibility was enhanced.

Key words：Escherichia coli, Xylose metabolism, Succinic acid,Bioelectrochemical system, electron shuttles

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1大肠杆菌产丁二酸的研究进展 1

1.2丁二酸合成过程中辅酶代谢调控 2

1.3生物电化学系统简介 2

1.4生物电化学系统中电子传递机制 3

1.5本论文研究目的及主要研究内容 4

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.2 实验方法 7

第三章 结果与讨论 11

3.1 大肠杆菌木糖发酵实验 11

3.2 电子载体浓度筛选 11

3.3 循环伏安曲线 12

3.4 电化学系统下大肠杆菌木糖发酵实验 13

3.5 两种发酵体系下辅酶代谢分析 14

第四章 总结与展望 16

参考文献 17

致 谢 19

第一章 引言

1.1大肠杆菌产丁二酸的研究进展

丁二酸，即琥珀酸, 作为三羧酸循环(TCA)的中间产物之一，存在于动植物及微生物的体内。丁二酸具有诸多的优良性质，可以用来合成多大宗化学产品如1,4 -丁二醇、四氢呋喃、C-丁内酯等，具有较大的经济价值^[1], 广泛应用于合成塑料、橡胶、医药、食品、涂料等工业中。

生产琥珀酸的方法较多，但工业上常用的方法为催化加氢法、石蜡还原法和电化学法^[2]。以催化加氢法为例，该方法是从丁烷合成顺式丁烯二酐来直接生成琥珀酸。此方式生产的缺点是操作条件就高，环境污染严重,因此琥珀酸无法得到广泛的利用。在此背景下，人们使用微生物发酵法来生产琥珀酸。并且，微生物发酵生产丁二酸可以以廉价的可再生资源糖和温室气体二氧化碳等作为主要原料,因此，微生物发酵生产丁二酸，克服了化学生产丁二酸对石油化工原料严重依赖这一缺点,同时将二氧化碳作为原料之一，更加彰显出其中的经济效益。

大部分的微生物都能在三羧酸循环的过程之中积累一定的丁二酸，但是能够产生高浓度丁二酸酸并耐受高浓度丁二酸盐的菌种并不多见。因此，选择发酵菌株成为了生物合成琥珀酸的关键之一^[3]。有学者以琥珀酸工业生产菌为出发菌种，设置条件进行筛选，筛选出了更耐单氟乙酸钠，丁二酸产量更高，生产强度更大的菌株。