甲醇是一种平台化工品，可由劣质煤炭制取，我国的甲醇产能已经超过4500万t/a，并呈继续增加趋势，而国内的甲醇需求量仅为1000万t/a，多数甲醇企业生存难以为继，急需开发甲醇下游产品。以甲醇为原料生产的甲醇蛋白称为第二代单细胞蛋白，可以缓解甲醇的供需矛盾。甲醇蛋白拥有高粗蛋白含量、富含必需氨基酸、矿物质和维生素等突出优点。目前，甲醇价格低廉，甲醇蛋白生产原料易得、资源丰富、生产不受气候条件影响、生产速度快、成本低，因此以甲醇蛋白代替传统的鱼粉和豆类等蛋白，将会降低饲料成本，提高饲养效率，大大弥补了约4800万t的蛋白饲料缺口，加速我国饲料工业的发展。同时，一些研究表明甲醇蛋白中的赖氨酸具有增强造血功能、增强抗病能力、提高蛋白质的利用率，所以甲醇蛋白在食品添加剂方面也有很大发展潜能。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能够高效表达外源蛋白的表达系统，具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点应用十分广泛。例如利用重组毕赤酵母产重组人红细胞生成素、猪α干扰素等特殊外源蛋白产品。毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌，其表达效率高，表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,且自身合成的蛋白很少，所以有利于目的蛋白的分离纯化，在简单合成的培养基中可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产。不同外源蛋白要求不同的发酵工艺条件，可从发酵培养基、补料调节、溶解氧浓度、菌体密度等多个方而进行优化，优化后外源蛋白表达量得到大幅度提升。

据研究报道，因为不同碳源在细胞生长和甲醇代谢过程路径的差异，所以不同的碳源在诱导期对细胞生长及外源蛋白的表达有很大影响。为了避免有毒中间代谢物的积累，提高最终目标蛋白质产量的提高，研究多碳源联合流加发酵的模式是很有必要的。可考虑采用葡萄糖/甲醇、纯甲醇、甘油/甲醇等流加培养方法，通过甲醇产量的对比得出最优方案。

研究内容：

菌种的取自实验室自藏菌种（-80℃甘油超低温保存），种子培养基采用酵母粉胰蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基，酵母培养采用无机盐培养基（氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙等）。

1.不同碳源对于外源蛋白产量的影响：分别用葡萄糖、甘油、甲醇作为发酵培养时的碳源，设置不同浓度梯度在温度30 ℃转速180 r/min的相同条件下培养48 h，测定甲醇蛋白产量，确定最佳碳源。

2.不同氮源对于外源蛋白产量的影响

分别利用酵母粉、氨水作为发酵培养时的氮源，设置不同浓度梯度在温度30 ℃转速180 r/min的相同条件下培养48 h，测定甲醇蛋白产量，确定最佳碳源。

3.金属离子对于外源蛋白产量的影响