摘 要

创伤导致周围神经损伤后的功能恢复目前仍是一个世界性的难题。其再生重塑过程中会伴随着瘢痕形成，神经内瘢痕形成会阻碍神经轴突再生及再生轴突穿越神经吻合口，不仅大大降低了神经再生的速度，还会导致神经断端肿胀，纤维化发生，从而引起疼痛及相关功能的丧失，严重影响患者生活质量。

据报道免疫抑制剂FK506具有明显的促进神经生长，抑制纤维化产生的作用。本论文首选筛选了合适比例的乳酸、羟基乙酸，并将合适比例的乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为载药电纺纳米纤维膜的主要材料。通过降解性能测试，包括失重率的变化以及pH的变化，来确定其合适比例。结果表明：50:50比例的PLGA具有更优异的体外降解性能。因此，我们选择了此种比例的材料进行静电纺丝，制备出纯PLGA纳米纤维膜和载药PLGA/FK506复合纳米纤维膜，并分别通过光学显微镜以及扫描电子显微镜观察其微观形态。扫描电镜图样显示：纤维直径在200-300nm之间，纳米纤维相互交叠，呈无序地纵横交错排布，形成三维网络结构，内部形成了孔隙，为细胞在材料上的粘附生长提供了充足的表面积和生长空间。最后进一步将两种纤维膜与人瘢痕细胞共培养，用CCK-8法检测细胞的生长增殖情况，并通过细胞死活燃烧来检测纳米纤维膜对瘢痕细胞的细胞相容性。结果表明：PLGA材料细胞相容性较好，载药PLGA/FK506复合纳米纤维膜在一定程度上可以抑制瘢痕细胞的生长。本实验将FK506载入神经导管材料中，探讨FK506复合神经导管材料修复周围神经损伤的疗效，为神经再生修复的临床研究提供理论依据和实验指导。

关键词：PLGA；静电纺丝；FK506；瘢痕细胞；细胞相容性

Abstract

The function recovery of the injured peripheral nerve is still a worldwide problem. The regeneration remodeling process will be accompanied by the formation of scar, and the formation of intraneural scar will impede axonal regeneration and axonal regeneration through the nerve anastomosis mouth which not only greatly reduce the speed of nerve regeneration, but also lead to the swelling and fibrosis of the end of the nerve, causing pain and relevant function loss, seriously affecting the quality of life of patients.

It is reported the immunosuppressant FK506 has obviously promotes to nerve growth and inhibition to fibrosis.This experiment will synthesis nerve conduit materials loaded with FK506, investigating its curative effect on peripheral nerve injury, and providing a theoretical basis and experimental guidance nerve regeneration.

The research discussed in this paper mainly focus on finding a suitable mol ratio of lactic acid to hydroxy acetic acid can form their product known as PLGA with a acceptable property of degradation in vitro as the main material of drug loaded nano fiber membrane. Through the degradation performance test, including weight loss rate change and pH value change, to determine the appropriate proportion. The result shows a ratio of 50:50 make a good degradation in vitro. Then, use this material to electro-spinning in order to produce the PLGA nano fiber membrane loaded with drug FK506 and pure PLGA nano fiber membrane, to observe their microscopic morphology by optical microscope and scan the microscope. The scanned electron microscopy patterns shows that the nano fiber diameter map in a range of 200 nm-300 nm, they are disorderly arranged in a crisscross pattern arrangement, forming a three-dimensional network structure, and interior pores are formed which provides a sufficient surface area for adhesive growth of cell on material. Finally, two kinds of fiber membranes were co cultured with keloid fibroblasts, the cell compatibility of nano fiber membrane are investigated by CCK8 method and cell death experiments. The results in certain level reflects a weak cytotoxicity from the PLGA and a acceptable cell compatibility, and concludes that the PLGA nano fiber membrane in this research loaded with FK506 is able to effectively inhibit the growth of keloid fibroblasts.

Keyword: PLGA; electrospinning；FK506；keloid fibroblasts；cell compatibility

目录

第一章 绪论 3

1.1周围神经瘢痕的形成机制 3

1.1.1神经瘢痕病理学变化 3

1.1.2神经瘢痕微环境变化 4

1.2抑制周围神经瘢痕的方法 5

1.2.1物理干预 5

1.2.2药物干预 5

1.3神经瘢痕修复材料的选择 7

1.3.1聚乳酸（PLA） 7

1.3.2聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA） 7

1.4静电纺丝技术 7

1.4.1静电纺丝基本原理 7

1.4.2静电纺丝优缺点 8

1.4.3静电纺丝技术的前景 8

1.5本文的研究内容 8

1.5.1目的与意义 8

1.5.2基本实验方案 9

第二章 电纺载药纳米纤维膜抑制瘢痕形成的作用研究 10

2.1引言 10

2.2实验部分 11

2.2.1实验材料与器材 11

2.2.2实验方法 12

2.2.3pH的变化 12

2.2.4失重率的测定 12

2.3结果与讨论 13

2.3.1不同比例PLGA失重率的变化 13

2.3.2降解液pH的变化 14

2.3本章小结 15

第三章 载药纳米纤维膜与瘢痕细胞的作用 16

3.1引言 16

3.2实验部分 16

3.2.1实验材料与仪器 16

3.2.2载药PLGA纳米纤维薄膜的制备与测试 17

3.2.3细胞CCK-8实验 17

3.2.4细胞死活实验 18

3.3实验结果与讨论 19

3.3.1PLGA纳米纤维膜的制备与测试 19

3.3.2细胞CCK-8实验 20

3.3.3细胞死活实验 21

3.4本章小结 22

第四章 结论 23

参考文献 24

致谢 25

第一章 绪 论

周围神经损伤非常常见和高发，神经损伤处成纤维细胞大量增殖，使得组织纤维化以及瘢痕的形成，瘢痕细胞的不断增殖生长导致神经吻合口发生拥堵，神经轴突无法穿越，这不仅大大降低了神经再生的速度，还会导致神经断端肿胀，发生神经纤维化，而引起患者运动障碍，感觉障碍，反射障碍等一些神经功能的缺失，严重影响患者生活质量^[1]。周围神经瘢痕的消除与抑制一直是临床医学界以及生物功能材料界研究的重点。至今为止，周围神经瘢痕形成的机制已经基本明确，瘢痕主要由成纤维细胞所产生的胶原蛋白合成异常并且发生沉积，导致纤维化而形成。目前已知的与瘢痕细胞生长最密切的细胞因子为TGF-β1，其通过与细胞表面对应的特异性受体结合来调节胶原蛋白的产生与沉积^[2]。在临床医学上，已有少数药品能够对神经瘢痕细胞的生长产生抑制作用，如雷帕霉素，他克莫司等。除了从现有的药品出发以外，科学家们也在设法从药物的使用方法着手，使其能充分的发挥更好的疗效。除了常规的口服以及注射以外，如今，实验室研究中也通常采用生物功能材料载药的方式来进行创伤的治疗，这种方法能够有效的控制药物的释放，并且对人体没有任何不良影响^[3]。

1. 1周围神经瘢痕的形成机制

周围神经瘢痕又分为神经周瘢痕以及神经内瘢痕，其中神经周瘢痕由神经周围的结缔组织增生而产生，神经内瘢痕由神经束膜，内膜以及外膜等神经支架结构增生形成^[4]。