摘 要

罗丹明荧光染料是一种氧杂蒽类荧光染料，早在1905年便已经被合成出来，早期只是一种用于纺织印染的染料。随着生命科学技术的发展，荧光成像在研究中发挥着重要的作用。因此，寻找一种具有优良性能的荧光染料显得尤为重要。而罗丹明因其优越的光稳定性能及较高的荧光量子产率等特点，开始受到研究者的关注和青睐，并逐渐成为一种成熟的生物荧光染料。

荧光成像技术为在活细胞/组织等复杂生物环境中对目标物的活性进行实时监测提供了可能。其中双光子荧光成像技术在活细胞方面具有成像深度深、信噪比低和样品光损伤小等优势，可以做到在组织中深层次高分辨率的荧光成像，使得研究者们能够清晰地观察到组织内部的变化。而线粒体作为细胞中的“能量工厂”，是我们研究细胞生物学必须考虑和研究的一种重要的亚细胞器。因此，合成性能优越的双光子荧光示踪剂将能够极大的推进我们对线粒体研究的进程。

本设计将N,N-二甲基-3-氨基苯酚与6-（氮二甲基）萘并[2,3-C]呋喃-1,3-二酮杂化，合成一种新型的类罗丹明荧光染料线粒体示踪剂，并详细研究了该示踪剂的生物体外光学性质。通过单光子及双光子荧光活细胞成像技术，检测示踪剂的在活细胞中的成像效果。结果表明，其能够很好靶向线粒体，为我们进一步研究线粒体，提供了很好的工具。

关键词：类罗丹明 双光子 生物成像 荧光示踪剂

Design the Synthesis and Bioimaging of a Novel Rhodamine-like Two - photon Fluorescent Dye

Abstract

Rhodamine is an oxygen anthracene fluorescent dye; it has been synthesized first in 1905. At the beginning, rhodamine was used as a kind of dye for textile. With the development of science and technology, fluorescence imaging plays an important role in the research. Therefore, it is particularly important to find a fluorescent dye with excellent properties. And, because of its excellent light stability and high fluorescence quantum yield, it has been widely caught researcher’s attention. And rhodamine-like dyes become a mature biological dyes.

Fluorescence imaging provides the possibility of real-time monitoring the activity of targets in complex biological environments such as living cells, tissues. The two-photon fluorescence imaging technique has the advantages of deep imaging, high signal-to-noise ratio and less light damage to living cells, and can achieve high-resolution fluorescence imaging. So that researchers can observe internal changes within the tissue clearly. And mitochondria as a "energy plant" in cells is an important subcellular organism that we have to study in cell biology. Therefore, the synthesis of the fluorescent tracer with mitochondrial localization capability and good two-photon fluorescence properties can provide an effective tool for studying of mitochondria function.

In this design, a new type rhodamine fluorescent dye has been introduced, by making N,N-dimethyl-3-aminophenol be combined with 6-(dimethylamino) naphtho[2,3-c]furan-1,3-dione. Photophysical properties in vitro and interference factors of the tracer have been studied in detail. In addition, the effect of tracer on the live cell imaging by one- and two-photon fluorescence imaging have been studied. The results show that it can well target mitochondria and provide a good tool for further research in mitochondria.

Key Words: Rhodamine; two-photon; fluorescent tracer; bioimaging

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1 荧光生物成像技术 1

1.1.1 荧光的过程和机理 2

1.1.2 双光子荧光 5

1.2 类罗丹明染料 6

1.2.1 类罗丹明染料的结构与分类 8

1.2.2 类罗丹明染料的性质 8

1.2.3 类罗丹明染料的应用 9

1.3 研究思路和技术方法 9

第二章 类罗丹明荧光染料的合成与检测 10

2.1 引言 10

2.2 实验部分 12

2.2.1 实验药品与试剂 12

2.2.2 实验仪器 13

2.2.3 罗丹明染料的合成 13

2.3染料的吸收和荧光光谱测定 17

2.3.1结果与讨论 18

2.4染料的生物成像 20

2.4.1肝癌细胞培养、着色 20

2.4.2细胞毒性测试 20

2.4.3共聚焦双光子显微成像测试 21

第三章 结论与展望 23

3.1 结论 23

3.2 展望 23

参考文献 25

附录 29

致谢 32

1. 引言

罗丹明荧光染料是以氧杂蒽为母体的荧光染料，是一种成熟的商业染料，具有较长的吸收/发射波长，高荧光量子产率等优异的光物理性能^[1]。同时，罗丹明荧光染料还具有水溶解性好，低毒性，在较大范围里对pH变化不敏感等特点，因此而受到广泛关注。

近年来，随着生物成像技术的进步及需求，双光子荧光成像技术得到快速的发展。双光子荧光成像技术与传统的单光子荧光成像技术相比具有许多突出的优点：(1)双光子荧光显微与成像技术一般采用在生物组织中穿透力较强的红外激光（~800 nm）作为激发光源，从而有效避免生物组织中深层物质的层析成像和生物细胞的光致毒问题；(2)由于双光子荧光波长远离激发光波长，因此双光子荧光显微与成像技术可以增加信噪比，实现暗场成像；(3)光漂白区域小；(4)双光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；(5)双光子荧光显微与成像技术具有更高的横/纵向分辨率。

本章就荧光生物成像技术和类罗丹明染料两个方面展开论述。

• 1. 荧光生物成像技术

近年来，小分子荧光探针吸引着越来越多的研究者，其已经成为研究生物领域的一种常用、有效的研究方法。其可以非常容易地进入到细胞中，并能够实现快速检测生物靶标，根据实际研究的需求，对探针进行特殊的设计，可以使探针的水溶性，动力学性能，激发/发射波长以及对特定细胞器的定位能力达到预期要求。因此，针对不同生物分子和亚细胞器，我们可以设计不同结构的荧光探针。其中大多数探针是通过利用荧光素，香豆素，BODIPY和罗丹明等常见荧光团开发得到的，这些探针可用于单光子成像技术^[2]。迄今为止，已经开发了数千个单光子探针，其中约2000个已被商业化。单光子成像技术出现较早也更为成熟，但由于其激发波长短，同时细胞内的本征荧光团吸收激发光时易引起自体荧光，如黄素腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等，导致单光子成像技术所得到的成像效果信噪比低。同时，由于在低波段，细胞或组织的光散射和吸收比较严重，使其组织穿透深度较浅^[3]。

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