论文总字数：22687字

摘 要

针对现今医学上关节损伤所导致的关节炎症以及软骨自我修复能力差，现存的替代支架材料结构和功能单一的问题，本文介绍了一种用于软骨修复的双层海藻酸钠基水凝胶支架，采用紫外光引发聚合法合成双层聚丙烯酰胺/海藻酸钠水凝胶，通过在下层加入纳米羟基磷灰石(n-HA)使其成为矿化层与软骨下骨接触，起到支撑作用并促进骨组织修复，在上层加入柠檬酸镁，促进软骨修复，共同构建双层水凝胶支架。论文主要研究了双层水凝胶支架的制备，以及理化性能的表征。并初步评价了对细胞活性和成骨矿化的影响。

研究结果表明：当海藻酸钠浓度为1.5%，丙烯酰胺浓度为12%，纳米羟基磷灰石含量为0.4%，柠檬酸镁含量为0.8%时，水凝胶有最高抗压强度，为173.0±16.6kPa。材料有一定的细胞毒性。随着柠檬酸镁/n-HA添加量的增加，材料细胞毒性呈现降低的趋势，表明柠檬酸镁和n-HA引入能够提高材料的细胞相容性。

关键词：软骨修复；海藻酸盐；水凝胶；双层支架

Abstract

In this paper, a double for cartilage repair sodium alginate hydrogel scaffold, using polymerization by UV irradiation synthesis double polyacrylamide/sodium alginate hydrogel, joined by the lower nanometer hydroxyapatite (n - HA) makes it the mineralized layer contact with the subchondral bone, to support and promote tissue repair, in the upper join magnesium citrate, promote cartilage repair, building common double hydrogel scaffold.The preparation of double-layer hydrogel scaffolds and characterization of physical and chemical properties were studied.The effects on cell activity and osteogenic mineralization were also evaluated.

The results showed that when the concentration of sodium alginate was 1.5%, the concentration of acrylamide was 12%, the content of nano-hydroxyapatite was 0.4%, and the content of magnesium citrate was 0.8%, the maximum compressive strength of hydrogel was 173.0±16.6 kPa.The material has a certain cytotoxicity.With the addition of magnesium citrate/n-HA, the cytotoxicity of the material decreased, indicating that the introduction of magnesium citrate and n-ha could improve the cytocompatibility of the material.

Keywords: cartilage repair ; alginate ; hydrogel ; bilayer scaffold

目录

第1章 绪论 1

1.1 软骨损伤与修复 1

1.1.1 软骨结构及骨软骨界面特征 2

1.1.2柠檬酸镁在软骨修复中的应用 4

1.1.3纳米羟基磷灰石在骨修复中的作用 5

1.2水凝胶支架 6

1.2.1水凝胶支架的结构与特性 6

1.2.2水凝胶的应用 7

1.3海藻酸盐 7

1.3.1海藻酸盐的结构与特点 8

1.3.2海藻酸盐水凝胶的研究进展 10

1.4丙烯酰胺的结构与特点 10

1.5本课题的研究目的与创新点 11

1.5.1本课题的研究目的与主要内容 11

1.5.2论文的创新点 12

第2章 单层水凝胶的制备与性能表征 13

2.1引言 13

2.2材料与方法 13

2.2.1实验原料与设备仪器 13

2.2.2海藻酸钠/丙烯酰胺水凝胶的制备 14

2.2.3海藻酸钠/聚丙烯酰胺水凝胶力学性能表征 14

2.3分析与讨论 14

第3章 双层水凝胶支架的制备与表征 16

3.1引言 16

3.2材料与方法 16

3.2.1实验原料与设备仪器 16

3.2.2双层水凝胶支架的制备 17

3.2.3双层水凝胶支架孔隙率的测定 18

3.2.4双层水凝胶支架溶胀比的测定 19

3.2.5双层水凝胶支架的茜素红染色实验 19

3.3分析与讨论 20

3.3.1双层水凝胶支架孔隙率 20

3.3.2双层水凝胶支架溶胀比 21

3.3.3双层水凝胶支架力学性能 21

3.3.4双层水凝胶支架的结构与形貌 22

3.3.5双层水凝胶支架的化学成分分析 23

3.4本章小结 24

第4章 双层水凝胶支架生物相容性测试 25

4.1 引言 25

4.2 材料与方法 25

4.2.1实验原料与设备仪器 25

4.2.2体外细胞毒性试验 26

4.3分析与讨论 26

4.4本章小结 28

第5章 结论与展望 29

5.1结论 29

5.2不足与展望 29

参考文献 31

致谢 33

第1章 绪论

1.1 软骨损伤与修复

随着现今社会人口的老龄化以及运动损伤的不断出现，骨关节软骨损伤等疾病的发生率在不断上升，这些疾病严重影响着人们的生活质量。关节软骨在滑膜关节中起重要作用，能减少相邻两骨的摩擦，缓冲运动时产生的震动，对哺乳动物的骨骼运动至关重要。关节软骨的缺损是临床常见的骨科疾病，在治疗方面还未见很好的治疗方法，成为临床治疗本病的一大难题,由于关节软骨缺少血液供应，更无淋巴及神经分布，加上软骨细胞代谢非常缓慢，软骨细胞分化程度又非常高，造成其分裂能力有限，所以损伤后自我修复能力极差。软骨损伤根据其深度的不同可分为部分软骨损伤、全层软骨损伤和骨软骨损伤，如图1.1。软骨一旦发生损伤并出现软骨下骨质暴露基本无法自身修复，因此其治疗问题为全世界骨科医生的研究热点^[1]。相关研究表明, 软骨损伤和修复均受到软骨下骨的影响, 软骨下骨为软骨修复提供固定支撑和营养输送等作用^[2,3,4,5]。骨软骨界面构造精细且复杂, 两者在解剖结构上相互连接, 在生物学功能上彼此影响^[4,5]。

图 1.1

临床传统的治疗方法可根据修复方法来分类，分为姑息性治疗、修复性治疗及再生性治疗，它们都有各自的局限性。近年来，组织工程逐渐成为新一代软骨修复技术。支架是组织工程三要素之一。现存关于骨软骨修复支架的报道多为构建促进骨、软骨生长的双层或多层支架进行修复。构建双相支架通常会采用两种不同材料，其中一种用来构建软骨层，另一种用来构建软骨下骨层，而多相支架则需加入第三种材料来构建界面层，以模拟天然骨软骨组织两层间过渡区的特性。这些支架通常依靠结构特点阻止血管侵入软骨层中，该结构通过模拟天然钙化层的成分、结构或功能来构建。材料在降解过程中，该结构会发生变化，孔径会增加，界面处通透性会增加，阻止血管入侵的功能也会丧失。一旦血管侵入软骨层，也缺乏抑制软骨内成骨的功能。如何阻止钙化层向软骨层推进及重塑，抑制软骨内成骨过程，是软骨修复的关键所在。

针对骨-软骨修复支架的缺陷，我们拟通过仿生结构设计合成双层支架，构建骨-软骨的界面，并设计一个骨整合层和一个软骨层。具体的方法是针对骨-软骨修复支架的缺陷，提出海藻酸钠/丙烯酰胺双层骨-软骨修复水凝胶支架的制备，采用丙烯酰胺的紫外光聚合效应快速固化生物医用高分子水凝胶，避免了离子交联和化学交联导致的双层结构破坏，在上层结构中加入抑制钙化的物质柠檬酸镁，阻止钙化层向软骨层推进及重塑，抑制软骨内成骨过程，在下层结构中加入成骨活性的物质，与软骨下骨形成良好衔接，发挥类似钙化层的屏障效应。这样就实现了具有多重功能的骨—软骨双层复合水凝胶支架的构建。

1.1.1 软骨结构及骨软骨界面特征

人体内的关节包括不动关节、微动关节(即软骨关节)和动关节(即滑膜关节)三大类。运动系统的基本结构是动关节，其允许在一定方向上轻松活动但是限制其他方向的活动，从而保证正常机体节段的稳定性^[6,7]。关节软骨 (articular cartilage，AC)存在于活动关节的关节表面，其具有一定弹性，具有润滑的功能和特性，并能将负重传导至软骨下骨。软骨中无血管、神经和淋巴腺，主要由分散的软骨细胞和细胞外基质构成。其细胞外基质主要由Ⅱ型胶原的网络结构和羽毛状的糖蛋白组成，其为软骨组织提供足够的力学强度^[2-4]。由于软骨细胞代谢不活跃、缺乏血液供应，因而受损软骨组织自我修复能力十分低下，这使关节软骨损伤的治疗成为了医学难题。早期软骨下骨功能的改变可以提示后期骨软骨缺损的进展^[10]。如果未及时得到治疗，关节软骨损伤会持续积累，关节面会逐渐丧失，暴露出下方的骨组织最终将导致严重的骨关节炎^[9,10]。

在解剖学上，关节软骨由三个结构区域所构成，它们分别是浅表区、中间区、深层区，如图1.2所示。浅表区占软骨总厚度10%～20%，位于浅层表面区域，是平行于软骨表面的片层结构；中间区顾名思义是指软骨中间的区域，其占总厚度的40%～60%；最下面30%左右是深层区，深层区内II型胶原聚集成纤维束，纤维束贯穿于软骨和钙化软骨的界面^[8]。关节软骨具有不均匀的结构和组成，其力学性能也表现出各向异性^[11]。关节软骨和软骨下骨共同构成了一个相互作用并且相互依存的复合功能单元，而存在于软骨与骨之间的骨软骨界面在结构和功能上起着承上启下的屏障作用^[12]。软骨和骨组织两者的组成成分不同，力学性能也不同，骨与软骨之间的界面尤为重要，它能减少应力集中，维持其力学结构的完整，缓解界面应力骤升，起到抑制血管侵入的屏障的作用，因此对骨软骨缺损的修复必须同时考虑骨、软骨和骨软骨界面^[12]。

1.1.2柠檬酸镁在软骨修复中的应用

柠檬酸镁又名枸橼酸镁，化学名为2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸镁，实验所用的是其九水合物，其性质较无水物稳定，便于称量计算。

医学上曾有过将柠檬酸镁应用于低镁血症的治疗。柠檬酸根和镁离子曾有过被合用于骨组织修复和替代治疗材料的先例，余素春构建了一种生物相容性好的磷酸镁基骨水泥药物缓释体系，其细胞实验证明磷酸镁基骨水泥细胞相容性良好^[13]。证明镁离子和柠檬酸根离子具有提高骨修复材料生物相容性的作用。

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