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摘 要

门冬酰胺酶是一种催化氨基酸门冬酰胺转化为门冬氨酸，并释放氨的酶。门冬酰胺是一种人体可以自己合成的氨基酸，但癌细胞由于缺乏门冬酰胺合成酶导致自身无法合成门冬酰胺，因此它们的生存依赖于细胞外循环的门冬酰胺。而外源性提供的门冬酰胺酶可以水解细胞外的门冬酰胺，进而导致癌细胞的死亡，因此门冬酰胺酶在肿瘤治疗中具有重要意义。

荧光探针因其特异性好和反应速度快等独特优势，已成为一种用于监测和成像癌症相关生物标记物的高效工具。而与单光子成像相比，双光子荧光探针由于其优异的性能，如弱的自发荧光和自吸收、低的光损伤和光漂白、更高的空间分辨率和更深的组织穿透等，使之更适合深层组织生物成像。

本设计拟在发挥小分子荧光探针的优势，开发出一种全新的门冬酰胺酶荧光探针，并详细研究该探针生物体外光物理学性质和干扰因素，为医疗工作者提供一种更便利的诊断工具。

关键词：门冬酰胺酶 双光子 荧光探针

Design, synthesis and biological application of a two-photon fluorogenic Probe for Asparaginase

Abstract

Asparaginase is an enzyme that catalyzes the conversion of amino acid asparagine to aspartate and releases ammonia. Asparagine is an amino acid that the body can synthesize by itself, but cancer cells cannot synthesize asparagine due to the lack of asparagine synthetase. So their survival depends on asparagine that circulates extracellularly. Exogenous asparaginase can hydrolyze extracellular asparagine and cause the death of cancer cells, so asparaginase is of great significance in tumor therapy.

Fluorogenic probes have become an efficient tool for monitoring and imaging of cancer-associated biomarkers because of their unique properties and fast response. Compared to single-photon imaging, two-photon fluorogenic probes have excellent performance due to their weak autofluorescence and self-absorption, low photo-damage and photo-bleaching, higher spatial resolution and deeper tissue penetration, which is more suitable for deep tissue bioimaging.

This design intends to exploit the advantages of small molecule fluorogenic probes to develop a new asparaginase fluorogenic probe, and research its photophysical properties and interference factors in vitro, finally providing a more convenient diagnostic tool for medical workers.

Key Words: Asparaginase Two-photon Fluorogenic probe

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 门冬酰胺酶的研究进展 1

1.2.1 门冬酰胺酶的来源 2

1.2.2 门冬酰胺酶的应用 3

1.2.3 门冬酰胺酶的检测方法 3

1.3 荧光探针的研究进展 4

1.3.1 荧光探针的简介 4

1.3.2 双光子荧光成像 5

1.3.3 酶荧光探针的设计机制 5

1.3.4 荧光探针的分类 7

1.4 本课题设计思路与研究意义 7

第二章 实验部分 9

2.1 前言 9

2.2 实验仪器与实验药品 9

2.2.1 实验仪器 9

2.2.2 实验药品 10

2.3 合成实验 11

2.3.1 合成路线 11

2.3.2 合成方法 11

2.4 分子对接 14

2.4.1 基本原理 14

2.4.2 模拟软件 14

2.4.3 模拟过程 14

2.5 光学性质测试 15

2.5.1 储备液的配制 15

2.5.2 酶缓冲液的配制 15

2.5.3 测试方法 15

第三章 结果与讨论 16

3.1 产物表征 16

3.1.1 TPAN-Asn-boc的表征 16

3.1.2 TPAN-Asn的表征 17

3.2 docking 结果 18

3.3 测试结果 19

3.3.1 紫外吸收和荧光光谱 19

3.3.2 响应与浓度梯度测试 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结果 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 27

第一章 绪论

1.1 引言

门冬酰胺主要参与蛋白质合成，它是一种非必需氨基酸，即人体可以自己合成这种氨基酸，不需要外部补充。但癌细胞由于缺乏门冬氨酸合成酶而丧失了合成门冬酰胺的能力，因此它们的生存依赖于细胞外循环的门冬酰胺^[1]。所以，细胞外循环的门冬酰胺酶对癌细胞的存在至关重要。外源性提供的门冬酰胺酶可以水解细胞外门冬酰胺并剥夺癌细胞，特别是对门冬酰胺消耗敏感的淋巴细胞，因此检测其在活癌细胞中的位置和表达水平在早期癌症诊断和监测疗法中具有相当强的重要性^[2-3]。

小分子荧光探针凭借其更高的灵敏度，非破坏性快速分析和实时检测能力，已成为生物系统中酶活性检测和成像的有力工具。此外，由于它们的结构可定制性，已经开发了许多小分子酶荧光探针以满足实时跟踪和可视化活癌细胞或体内不同酶等各种需求。而与单光子成像相比，双光子荧光探针由于其优异的性能，如弱的自发荧光和自吸收、低的光损伤和光漂白、更高的空间分辨率和更深的组织穿透^[4]等，使之更适合深层组织生物成像。虽然荧光探针的合成以及荧光生物成像已经有了不少的研究，但是设计合成出能够快速、实时、动态可视化示踪生物体内的荧光探针仍然是当前生命科学方向的重要领域之一^[5]。本章就门冬酰胺酶和荧光生物成像技术两个方面展开论述。

1.2 门冬酰胺酶的研究进展

门冬酰胺酶是一种催化氨基酸门冬酰胺转化为门冬氨酸，释放氨的酶（如图1.(a)所示）。该反应的底物和产物在从微生物到哺乳动物的许多代谢过程中具有重要作用。门冬酰胺也是植物中储存和运输氮的最丰富的代谢物。在人体内，门冬酰胺是一种非必需氨基酸，即人体可以自己合成这种氨基酸，不需要外部补充，而门冬酰胺主要参与蛋白质合成途径。因此，它对细胞的存在至关重要。但癌细胞缺乏合成门冬酰胺的能力，因为它们缺乏门冬氨酸合成酶，所以它们的存活依赖于细胞外循环的门冬酰胺。外源性提供的门冬酰胺酶可以水解细胞外门冬酰胺并剥夺其对癌细胞的供给，特别是对门冬酰胺消耗敏感的淋巴细胞，导致它们无法存活（如图1.(b)所示）。该方法主要用于治疗白血病。

图1.(a)门冬酰胺酶水解示意图；(b)门冬酰胺酶水解外源性门冬酰胺示意图

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