论文总字数：20835字

摘 要

亚硫酸盐作为一种常见的食品添加剂，被广泛用于食品、饮料和药品。研究表明，人体中过量摄入亚硫酸盐会对细胞和组织产生很大毒副作用，不仅会诱发呼吸道疾病，也参与了心血管疾病、癌症和许多神经系统疾病的发生。因此，精确监控食品中亚硫酸盐的含量十分必要。基于此，本论文构建了一种基于聚多巴胺量子点（PDADs）的荧光增强型亚硫酸根纳米探针，并在葡萄酒中对其应用进行了验证。

在室温条件下，用多巴胺（DA）和去离子水于暗室中采用一步氧化法合成聚多巴胺量子点PDADs，当Na₂SO₃被加入到PDADs溶液中时，由于亲核加成反应，将导致荧光增强效应的产生，即构建了一种检测SO₃^2-的荧光探针。该荧光探针能特异性识别亚硫酸根（SO₃^2-），且制备简单、灵敏度高、生物相容性好且毒性低。探针的适用检测范围为0.01-0.2 μM，检测限为8 nM，并成功地检测了白葡萄酒样本中亚硫酸根的含量。该研究为进一步开发基于PDADS的探针并进一步应用于拓展在生物医药、食品检验等领域奠定了基础。

关键词：聚多巴胺量子点 亚硫酸根 荧光增强 食品检测

Abstract

As a common food additive, sulfite is widely used in food, beverage and medicine. However, accumulating studies have shown that excessive intake of sulfite will cause severe impairment to the body and induce the occurrence of various diseases such as respiratory diseases, cardiovascular disease, cancer, and neurodegenerative diseases. Therefore, it is necessary to precisely monitor the concentration of sulfite. To this end, a nanofluorescence probe based on polydopamine quantum dots (PDADs) for the detection of sulfite has been constructed and we also validate its application in detecting sulfite of whiter wine.

The polydopamine quantum dots (PDADs) were synthesized by one-step oxidation of dopamine (DA) in deionized water in a dark environment at room temperature. Then the PDADs were characterized with TEM, AFM, FL. After that, Na₂SO₃ was added into the PDADs solution, the fluorescence enhancement effect was triggered by the nucleophilic addition reaction of polymethine. The intensity of fluorescent signal of PDADs showed linear correlation with the concentration of SO₃^2-. The fluorescent probe exhibited excellent properties such as simple preparation, excellent specificity, high sensitivity, good biocompatibility, and low toxicity. The detection range of SO₃^2- is 0.01-0.2 μM, with the minimum detection limit 8 nM. Furthermore, We applied this probe in detecting SO₃² in white wine samples, and it showed excellent applicability. It suggests that PDASs are good candidates for developing probes for biology and food safety inspection.

Key Words: Polydopamine quantum dots; Sulfite fluorescence; Food testing; Fluorescence enhancement

目录

摘要 I

第一章 绪论 1

1. 选题背景 1

1.1. 亚硫酸根的应用与危害 1

2. PDA的概述 1

2.1. 纳米荧光探针 1

2.2. PDA的特性 2

2.3. PDA的制备 4

2.4. PDA的应用 5

3. 课题的设计思想及意义 5

第二章 PDADs探针的制备及应用研究 7

1. 试剂与主要仪器 7

1.1. 试剂 7

1.2. 主要仪器 7

2. 实验方法 7

2.1. PDADs的制备与表征 7

2.2. PDADs的荧光特性分析 8

2.3. PDADs选择性分析 8

2.4. 亚硫酸根的浓度检测 8

2.5. PDADs在白葡萄酒中的分析检测 8

第三章 结果与讨论 9

1. PDADs的制备与表征 9

2. PDADs的荧光特性分析 9

3. PDADs选择性分析 10

4. 亚硫酸根的浓度检测 10

5. PDADs在白葡萄酒中的分析检测 11

第四章 结论与展望 13

参考文献 14

附录 18

致谢 19

绪论

选题背景

亚硫酸根的应用与危害

二氧化硫（SO₂）是空气中一种重要的有害污染物，其衍生物亚硫酸盐也被广泛用作食品、饮料和药品的防腐剂。大量的流行病学研究已经证实，人体中过量的SO₂会对细胞和组织产生很大的毒性作用，不仅会诱发人体大量的呼吸道疾病，也与心血管疾病、癌症和许多神经系统疾病密切相关^[1]。二氧化硫极易水化生成SO₂衍生物：亚硫酸根离子（SO₃²⁻）和亚硫酸氢根离子（HSO³⁻）^[2]。因此，SO₂的浓度可以通过间接检测SO₂衍生物总浓度来确定。

迄今为止，检测体外或体内的SO₂衍生物的方法主要有如下几种：分光光度法、毛细管电泳、色谱法和荧光探针等。与其他技术比较，荧光检测法由于其灵敏度高、选择性强、操作简单和能够实时成像等特征，已被视为最具有应用前景的解决活细胞检测的技术方案。到目前为止，开发的检测SO₂衍生物的荧光传感器主要是基于有机染料，如Sun等人^[3]于2013上报道的一个香豆素半华菁杂化染料通过加成重排串联反应比率型荧光检测SO₂衍生物，其检测限为3.8×10 M。Wang等人^[4]于2017年在报道了一个基于花菁染料的有机荧光探针，通过亲和加成反应能够在水中和活细胞中比率型荧光检测SO₂衍生物，其检测限为5.86×10⁻⁸ M，Ye等人^[5]于2018年在报道一种基于亲核加成反应的荧光探针，通过比色和比率型荧光两种方法来检测环境和活细胞的SO₂衍生物，其检测限为2.8×10⁻⁸ M。以上检测方法普遍存在检测限低，细胞毒性较大，使用溶剂不友好和合成过程复杂等不足。

PDA的概述

纳米荧光探针

荧光纳米粒子（Fluorescent Nanoparticle, FNP）是一种新型荧光材料，具有极高的稳定性与亮度，且没有毒性，没有异味且环境友好的特点，表面具有高度化学活性易于修饰，且作为生物材料则能够在水溶液中均匀地分散并且具备良好的生物相容性，较之传统材料具有独一无二的优势。FNP主要为两类，一种是无需外界提供能量自身就可以发出荧光的半导体纳米微晶体（即量子点Quantum Dot）；另一种是通过包裹埋附、强有力的共价键连接以及利用非共价力而组合的超分子组装等方式把荧光基团与有机或无机纳米离子相结合，从而取代有机小分子荧光染料——能够在无机物以及生命体中进行检测、标记等的优势被广泛应用于生物医学领域。在FNP中，聚合物荧光纳米粒子（PFNPs）独占鳌头，因其具有细胞毒性低、易于表面功能化、成本低等优势，在化学传感器、荧光成像、药物输送和生物分析等应用领域中受到研究人员极大的关注^[7]-[11]。PFNPs主要由具有共轭主链或芳香族结构单元（如苯环）的共轭聚合物组成，同时可以产生强烈的荧光发射光谱^[12]。然而，大多数共轭聚合物自身水溶性极差，将其应用于生物领域时必须进行功能性修饰，PFNPs仍有待进一步改进。鉴于此，研究人员开始探索借助非共轭聚合物纳米粒子（NCPNs）来解决水溶性的问题。近年来，已经开发出许多广泛被应用于生物传感器中的应用以及基因和药物递送的NCPNs^[13]。然而，其制备和应用仍然存在一些缺陷，例如合成路径繁多复杂，使用的有机溶剂具有污染性和产出的荧光量子产率（QYs）低下等。因此，如何开发出一种具有良好水溶性、易于制备和高荧光量子产率的自发荧光聚合物材料，是一个亟待解决的问题。

PDA的特性

聚多巴胺的诞生与一种人们尤为熟知的双壳类软体动物——贻贝有关，因贻贝在水下强劲的黏附力备受关注^[14]，即使在巨浪的冲击下仍然能够紧紧地附着于轮船，礁石上。同时，贻贝还可以凭借高粘合强度牢固地附着在多种基材上，其中包括四氟乙烯（PTFE），一种典型的“抗黏附材料”。贻贝之所以具备极佳的湿附着性能，是通过纺丝螺纹的方式附着在不同的基体上，Waite等^[15]通过实验，从该动物的副分泌足部的苯酚腺体中提取并纯化了一种酸溶蛋白，这种高度碱性的蛋白含有大量的赖氨酸、多巴和3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)，其组成和它在体外的粘性倾向强烈地表明它有助于形成附属物。而Messersmith研究小组^[16]在2007年则进一步发现了贻贝足丝蛋白（Mytilus edulis foot proteins，Mefps），其中含有5种DOPA黏性蛋白Mefp1-5，它们的功能就是使得贻贝能够在潮湿的环境中迅速固化，从而使得贻贝能够有力地粘附在材料的表面，基于此原理，他们开发出一种新型涂料，即分子结构类似于DOPA的聚多巴胺（PDA），继而引发了一波研究热潮。

黏附性

聚多巴胺其最重要的性质之一，也是备受关注的原因之一，就是无论基质的化学性质如何，它对几乎所有类型的表面都具有强大的粘附性。而聚多巴胺与其底物之间的相互结合取决于底物的表面状态，分为两种方式：①非共价结合；②共价结合。在pH~=7.0的环境下，聚多巴胺具有类似于多巴胺的性质，能够轻松地与底物发生非共价结合相互作用，通过金属配位或螯合，氢键连结，堆积和醌-氢-醌电荷转移生成配合物，产生有效吸附层。共价结合机制适用于在碱性条件下那些表面上含有胺和/或硫醇基团的一些特定底物，可以通过迈克尔加成反应和/或发生席夫碱反应。由于PDA的化学结构中包含许多官能团，例如儿茶酚（C₆H₆O₂），胺（-RNH₂）和亚胺（-R₂NH），这些官能团既可以在共价修饰中作为所需分子的起始点，也可以作为过渡金属离子的锚点，由于在碱性条件下，PDA对于这些金属离子表现出强大的还原能力，可以进一步满足各种杂化材料的实现条件。若在室温条件下将混合了盐酸多巴胺的Tris溶液和干燥的聚苯乙烯（PS）粉均匀搅拌，36小时后就将生成聚苯乙烯/聚多巴胺（PS/PDA）微球；同理，还可以将聚苯乙烯（PS）替换为四氧化三铁（Fe₃O₄）同样与混合了盐酸多巴胺的Tris溶液中进行搅拌，24 小时后就将生成四氧化三铁（Fe₃O₄/PDA）微球复合体^[17]。

亲水性

由于表面存在许多官能团如羧基（-COOH），氨基（-NH₂），亚胺（R₁R₂-C=N-R）和酚基（X-OH）使得聚多巴胺能够以高亲水性的形态分散在各种溶剂中。当其表面涂有聚多巴胺时，无论是亲水性或疏水性底物，其表面能都会发生剧烈变化。例如，经多巴胺Tris缓冲液（pH 8.5）处理24 h后，L-聚乳酸（PLLA）表面能的极性组分从9.6 mJ/m²升至42.6 mJ/m²，正揭示聚多巴胺的极性和亲水性。而在聚合反应发生48 h后，水接触角的范围可以降低50°以上。但一般来说，根据基材的不同，经聚多巴胺涂布后的水接触角会降到37-90°的范围内。而对于一些特殊的基材，该值可降至20°以下。因此说明聚多巴胺能够明显地改善其包覆物的亲水性。

稳定性

与利用硫醇、硅烷或磷酸盐等通过化学锚固的方法相比，PDA只需要在水溶液中即可生成对于目标粒子的包覆，证明了PDA较于以上材料具有更加良好的稳定性。例如合成的Fe₃O₄/PDA核壳微球，影响其稳定性的因素有两种：①在水溶液中的降解；②对抗酸性环境的腐蚀作用。而实验恰恰证明了PDA具有优异的稳定性：当PDA微球分散在10 mL的纯水中即使经过半年的时间仍然能够保持PDA层的厚度几乎不变薄且保持的原有的形态；同时即使在强酸性条件下PDA层也能够保护所包覆的Fe₃O₄不被酸性环境刻蚀。同样地，PDA也能够对不锈钢进行表面改性，利用电化学阻抗谱探索改性不锈钢在3.5%的氯化钠溶液中随温度与时间的能力，以判断其耐腐蚀的能力。实验结果表明PDA层具有良好的强度高的结合性，不易分解变性的稳定性，以及优异的抗腐蚀性，且其包覆的颗粒在热重分析（TG）测试仍然呈现较好的热稳定性，热分解温度明显升高^[18]。

生物相容性

生物相容性是材料能否在生物医学领域进行特定性应用的适用性的关键因素，动物实验及临床应用对材料的生物相容性要求更高。作为人体内广泛分布的天然黑色素的主要成分，聚多巴胺也具有优异的生物相容性，可以显著减少用于人体时带来的不良反应。之前人们认为聚多巴胺材料的荧光性质不理想，不适用于荧光成像应用，但近期的研究表明，可以通过技术改造合成具有荧光增强效应的聚多巴胺有机纳米颗粒。

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