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摘 要

环糊精葡萄糖基转移酶( CGTase，EC 2.4.1.19) 是α-淀粉酶系的一员，它是一种多功能酶，能够催化环化、耦合、歧化和水解这四种反应^[1]。2-氧-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid，AA-2G），是一种抗坏血酸（L-ascorbic，L-AA，Vc）的糖基化衍生物。相比于L-AA易被氧化的缺点，其在水溶液中的稳定性强，所以常被运用在化妆品、医药、食品、工业农业等领域。就现在而言，主要用生物酶法合成来生产AA-2G，其中常用CGTase来催化Vc生成AA-2G。

本课题将密码子优化过后的cgt基因异源表达在大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中，然后通过对培养条件进行优化，即碳源种类的优化、碳源浓度的优化和IPTG诱导剂浓度的优化来提高环糊精葡萄糖苷转移酶的酶活，并利用环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液催化Vc生成AA-2G。以α-环糊精为糖基供体，得到AA-2G 9.1 g/L。以β-环糊精为糖基供体，得到AA-2G 4.9 g/L。

关键词： 环糊精葡萄糖苷转移酶 2-氧-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸 Vc 异源表达

Expression of Cyclodextrin Glucosyltransferase in Escherichia coli and Its Application

Abstract

Cyclodextrin Glucosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) belongs to the α-amylase, which is a multifunctional enzyme that catalyzes cyclization, coupling, disproportionation and hydrolysis. 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid (AA-2G) is an ascorbic acid (L-ascorbic, L-AA, commonly known as Vitamin C) derivative. Compared to L-AA, it is stable in aqueous solution. At present, people mainly use biosynthesis to produce AA-2G, which commonly used cyclodextrin glucosyltransferase to catalytic Vc to produce AA-2G.

     In this study, codon optimized cgt gene was heterologous expressed in E.coli, and the culture conditions were optimized to improve the enzymatic activity of cyclodextrin glucoside transferase and catalyzed by crude enzyme of cyclodextrin glucoside transferase Generate AA-2G. Using α-cyclodextrin as the glycosyl donor, 9.1 g/L of AA-2G yield was obtained. Using β-cyclodextrin as the glycosyl donor, 4.9 g/L of AA-2G yield was obtained.

Key Words:Cyclodextrin glucosidetransferase，2-O-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid，Vc heterologous expression

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

第二章 文献综述 2

2.1 2-氧-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸的概述 2

2.1.1 L-抗坏血酸及其衍生物的简介 2

2.1.2 AA-2G的功能和应用 3

2.1.3 AA-2G酶法转化简介 4

2.2 环糊精葡萄糖基转移酶的概述 5

2.2.1 CGTase的来源、特性 5

2.2.2 CGTase的应用 6

2.2.3 CGTase的异源表达 6

2.3 课题来源及研究内容 6

2.3.1 课题来源 6

2.3.2 本课题研究内容 7

第三章 材料与方法 8

3.1 实验材料 8

3.1.1 菌体和质粒 8

3.1.2 主要试剂 8

2.1.3 主要仪器 8

3.1.4 培养基 9

3.2 实验方法 10

3.2.1 基因工程菌的构建 10

3.2.2 基因工程菌的保种 12

3.2.3 重组CGTase酶的分泌表达及酶活测定 13

3.2.4 培养条件的优化 14

3.2.5 AA-2G的生产 14

第四章 结果和讨论 16

4.1 CGTase在E.coli 中的异源表达 16

4.1.1 大肠杆菌表达系统的构建 16

4.1.2 重组酶在E. coli BL21(DE3) (pET-28a( )/cgt)中的胞外生产 17

4.2 培养条件的优化 18

4.2.1 碳源种类的优化 18

4.2.2 碳源浓度的优化 19

4.2.3 IPTG诱导剂浓度的优化 20

4.3 AA-2G的生产 20

第五章 结语与展望 22

5.1 结语 22

5.2 展望 22

参考文献 23

致谢 26

第一章 引言

维生素C又叫L-抗坏血酸，在人体中发挥重要作用，其具备许多生物活性，比如促进氨基酸代谢，促进肾上腺激素合成，能更大程度的吸收钙、铁和叶酸，调节血脂，使牙齿、骨骼的生长速率加快，强化了肌体的免疫力以及抗应激能力等^[2,3]。然而由于Vc在水溶液中极不稳定，易被空气中氧和其它氧化剂所氧化，从而限制了其应用，因此急需开发Vc衍生物来提高Vc的稳定性。

相比于Vc的其他衍生物，AA-2G因其稳定性强，安全性高以及生产方法简单而受到人们关注^[4]。AA-2G进入了人类的身体之后，通过我们身体里的α-葡萄糖苷酶的作用，缓慢分解变成Vc以及D-葡萄糖。因此，AA-2G作为Vc的前体分子，它既能够克服Vc具有的的不稳定性，又可以在人体细胞中发挥Vc所拥有的生理活性，所以它是Vc最好的的替代品。在现实中，AA-2G在食品、化妆品、医疗、畜牧业和水产养殖等行业都开始了广泛的运用。

AA-2G普遍是由生物法进行合成的，而且环糊精葡萄糖基转移酶可以催化出不同的反应，一共有4种，其中有3种是转糖基化反应(歧化反应、环化反应、偶合反应)和水解反应，它可通过转糖基作用把葡萄糖基转接到在Vc的C₂位上，从而合成AA-2G。因为CGTase具有的产物特异性强的特点，所以成为了在AA-2G生物酶法合成中最为常用的酶种。

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