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石墨烯作为细胞界面：与细胞的机电耦合

Ravindra Kempaiah, Alfred Chung, and Vivek Maheshwari

The Nanotechnology Engineering Program, Department of Chemistry, University of Waterloo, 200 University Avenue West, Waterloo, Canada N2L 3G1

摘要

细胞与纳米材料诸如石墨烯、纳米线、碳纳米管的结合对于细胞的生理学和电相关的一体化研究有很大的作用。这篇文章中我们展示了酵母菌表面与石墨烯片的交互界面，并在细胞与片层间产生了机电耦合作用。形成交互界面后细胞是活性的。通过将细胞暴露于酒精中生理应力造成了细胞的应激响应，这使得细胞的体积发生变化，并通过石墨烯可以观测到相应的电信号。细胞体积的变化导致了片层的应变，并产生了减少电导率的褶皱。由于细胞的动态响应可以被滚测到，可以区分开乙醇、异丙醇或者水对其的影响。我们相信这也将引领基于细胞的电子设备及传感器的更深远的发展。

关键词

细胞 纳米生物电子学 机电耦合 细胞动态反应 石墨烯

近几年来有关与细胞导电界面的纳米材料正在被积极的研究。这些纳米材料可以被用于传感细胞反应，因此其潜在的应用包括传感器、生物医学设备和能量采集系统等。尤其是纳米线场效应晶体管、碳纳米管和最近的石墨烯也被运用以达到这一目的。在这些设备中细胞被放置在场效应晶体管的位置上以形成一个导电的细胞界面。在这篇文章中我们展示了表面包覆了化学还原石墨烯片的真核酵母菌细胞。还原石墨烯片沉积在细胞表面以形成一个导电层并证明了其与细胞的机电耦合。因为氧化石墨烯片在细胞表面，细胞体积和表面应力的变化可以被观测到。这种机电耦合可以被用于研究细胞表面应力的动力学过程，这一过程在细胞生长、分裂以及对诸如渗透压等生理学因素的反应等过程中都十分重要。尤其是氧化石墨烯片这一二维导电材料有着极高的载流子迁移率，以及高的机械模量、机械强度和光透过性。同时，氧化石墨烯片微米尺度的尺寸也使得它成为理想的适应于细胞表面界面形成而不输送进入细胞质的材料。它们纳米尺度的厚度和其机械特性也使得氧化石墨烯片的导电性能对细胞表面结构变形极其敏感（由于细胞表面涟漪及褶皱的形成）。这一作用也被用于实时电监测细胞对乙醇和丙胺环境下的生理应激反应。因为其导电性能的瞬态变化可以被记录，细胞对施加应力的细微变化也是有特征的。

结果和讨论

酵母菌细胞，酵母属酿酒酵母，其特性已被很好的描述，也被广泛的运用于生物技术中新工具的开发。这也使得它成为理想的开发电化学设备以研究细胞反应的微生物。在这里，其易与钙离子结合的习性给它与氧化石墨烯片形成连接界面提供了桥梁。该过程基础的实施计划在图1a中展示（更为详细的过程在支撑材料中）。简单地说，钙离子与柠檬酸盐功能化后的金纳米颗粒（12nm）形成了钙金体系。随后，氧化石墨烯片（hummer法制备），它的羧基和羟基易与钙金体系纳米颗粒形成界面。这一结合的结果在中场制发射电子显微镜中和透射电子显微镜中的图像表现为图1b,c，钙金体系纳米颗粒被观测到像项链一样吸附在氧化石墨烯片上面。然后，使用葡萄糖和氨水可以将氧化石墨烯-钙-金体系还原为还原石墨烯-钙-金体系。石墨烯和氧化石墨烯的拉曼峰上有着G和D两个特征峰，在还原石墨烯上其G峰的强度有相应的减少（详细见支撑材料）。其pH值保持中性。对于扫描电镜特征描述，还原石墨烯-钙-金体系片在被硅烷处理后被吸收在二氧化硅基底上（平的基底并且载有金电极）。因此没有溶液蒸发效果。透射电镜和扫描电镜的图像在质量上相似。表面的钙离子起到了在界面处结合还原石墨烯片及酵母细胞的作用。

取最初长成的时的酵母菌并清洗两次，然后加入还原石墨烯-钙-金体系（详情见参考文献）。室温下在最初的一小时潜伏期后将还原石墨烯-钙-金体系细胞放置在有金电极的硅烷处理的二氧化硅基底上。样品的扫描电镜清晰的显示出还原石墨烯在细胞表面以及上面的钙-金纳米颗粒（见图2a）。若没有钙-金纳米颗粒，则细胞表面不能观察到有效的还原石墨烯片沉积（见图2d），同时溶液也有负的zeta;电势。从图像中也可以看出电极和细胞表面上的还原石墨烯片有好的导通性（见图2b）。虽然还原石墨烯-钙-金体系片沉积在细胞壁上（细胞壁包覆着细胞膜），它依然让细胞膜能够正常工作。而且沉积在细胞表面的还原石墨烯片之间的缝隙足以使细胞维持与环境的正常物质能量交换过程，使得细胞可以正常生存。细胞活性测试结果表明细胞在与还原石墨烯-钙-金体系片结合后仍能健康地维系正常的新陈代谢活动。在活性测试中，用荧光增白剂以及FUN1染剂活性指标处理还原石墨烯-钙-金体系片包覆后的细胞并进行培养，可进行新陈代谢的活性细胞会吸收FUN1染剂到液泡中并且将其荧光特性从绿色转变为红色（见图2e），因此，在细胞中显示出红色斑点。荧光增白剂有着蓝色的荧光特性并且仅仅染色细胞壁。图2f是堆积细胞的三维共焦成像图，这张图上显示出细胞内部有来自FUN1的红色斑点以及在细胞表面的蓝色荧光（细胞边缘有高密度的蓝色光）（更多图像在支撑材料中）。细胞壁的蓝色染色以及细胞内部的红色斑点荧光染色的存在也证明了染剂可以通过还原石墨烯片层的间隙并且扩散进入细胞并与细胞发生作用。细胞在还原石墨烯-钙-金体系片包覆后用FUN1染剂染色并进行培养这一过程仅仅对荧光强度有所减少但并不改变其发射光谱（见支撑材料）。

还原石墨烯-钙-金体系细胞被放置在硅基底上的间隔约为2微米的金电极上以形成电子细胞。图3a显示了这种细胞的电流电压特性。我们可以观测到没有迟滞现象的线性响应，这表明细胞和电极有一个好的粘附。而且钙金体系细胞被放置在电极上面并没有得到可测得的电流（图3a），因为细胞壁主要是由碳水化合物组成的，而沉积在细胞表面的钙金纳米颗粒链并没有足以形成电子流通路径的密度。钙金纳米颗粒的密度被钙金纳米颗粒相对于细胞的浓度限制。普通细胞同样没有展现出好的导电性能（支撑材料中有放大的图像）。然而，还原石墨烯-钙-金体系片在其与细胞的交互界面形成了电子的传导通道，这是由于这种片层的二维结构有着大的表面区域。当细胞被暴露在酒精中时，细胞会进行生理应激并且这种细胞响应会与还原石墨烯片发生机电耦合进而被观测到。图3b显示了观测结果，还原石墨烯-钙-金体系细胞的电导系数随着细胞被暴露在酒精里可逆地减少。暴露时间被限制在低于3分钟以防止对细胞造成不可逆的损伤。当细胞被暴露酒精在醇类里（如乙醇或者异丙醇），酵母细胞的细胞体积会减少而表面粗糙度会增大。这种细胞响应导致放置在细胞表面上的还原石墨烯片产生压应力。这种应力使得还原石墨烯片层产生折叠和涟漪，在观察中这也增加了载流子的散射因此减少了还原石墨烯片的电导系数。在暴露于酒精中后还原石墨烯-钙-金体系细胞的电导系数的减少存在两个步骤过程，首先，电导系数的量级存在一个立即的减少，随后可以观察到一个渐进的下降速率（图3b）。为了进行对照，我们将普通的原石墨烯-钙-金体系片暴露于酒精中（或者其他醇类）并没有显示出任何电导系数的减少（见支撑材料）。这意味着上述观察现象并不是由于酒精与石墨烯片之间的交互作用导致的。而且氧化石墨烯-钙-金体系细胞比还原石墨烯-钙-金体系细胞在在电导系数上低了两个阶级，因此也限制了他们在细胞对于生理应激的传感的运用（图3d）。还原石墨烯-钙-金体系细胞在暴露于1mol/L的氯化钾溶液中（由于渗透压应力）也展现出在电导系数上的减少，然而与将其暴露于YPD营养液体培养基相对比，在这一情况下电导系数几乎是恒定量并有一个微小的增加（图3c）。这也显示出这一设备响应是由于细胞本身的行为而不是由于液体的电介质作用或者接触电阻，因为这里的每一个实验都是在相同的1mol/L氯化钾和YPD溶液中进行的，都是在水介质中的。

由于将细胞暴露于乙醇所受应力冲击和由于细胞所受的热冲击对于细胞在体积上的影响在性质上是一致的，二者都导致了细胞表面的的压应力。图4的a-c是三张在场发射扫描电镜电子束持续轰击下（热冲击）的图像。细胞体积随着暴露时间而收缩，同时还原石墨烯片在细胞表面也会出现褶皱。图4e是从线扫描计算得到的细胞收缩，当暴露时间从15s变为45s时，细胞收缩导致的侧向应变从4.4%变为7.8%。将这种细胞放置在基底上观察得到相较于将还原石墨烯-钙-金体系细胞暴露于酒精中其电流有明显的减少。并且将细胞暴露于70%乙醇十分钟前后两个时间点得到的光学图像也显示出细胞体积的减少（详见支撑材料）。如果将暴露于酒精时间从十分钟延长至更久，将会导致永久的电流减少，这也意味着其对细胞造成永久的伤害。将还原石墨烯-钙-金体系细胞暴露于酒精十分钟后其表面的粗糙度可以直观的从原子力显微镜图像中看出（图5a-c）；细胞表面的褶皱是清晰可见的，这也证明了在经受应力冲击后还原石墨烯片的变形。变形主要为10-25nm的高度变化以及显现出一种有规律的间隔（图5c）。未暴露的细胞其表面平滑并且其表面粗糙度小于2nm。

细胞对于酒精的动态反应（细胞体积的减少以及细胞表面变得粗糙）是由于酒精的疏水性，这也影响其渗透通过细胞质膜的能力。更多的亲水成分将有助于酒精快速渗透进入细胞并且导致一个更快的细胞应激响应。因为细胞与还原石墨烯片进行耦合，细胞响应速率也反应在还原石墨烯-钙-金体系细胞设备的电导率上。两个可测得的参数C_step和Delta;C_slow被用来描述细胞对酒精应力冲击的反应。出于这一作用，还原石墨烯-钙-金体系细胞被暴露于五种不同浓度的酒精中（99%，90%，80%，70%和60%五种体积分数），见图6a。在观测中电导率C_step的初步减少随着水分的增多在量级上变得更大（详细的图在支撑材料中）。图6b总结了这一应力冲击对还原石墨烯-钙-金体系细胞系列实验的结果。当还原石墨烯-钙-金体系细胞被暴露于60%的酒精溶液中时，可以观测到电导率更加不可逆的改变，这意味着对于细胞形态的一个永久的变化。这象征着体积分数60%的酒精渗透进入细胞的效率最高。同样用90%的异丙醇也降低了电导率C_step的初步减少的量级。随着溶液疏水性的增加电导率Delta;C_slow逐步减少量级变得更加重要。响应的二重性（一个快速的C_step和一个更加慢的渐变的Delta;C_slow）可以从细胞形态由于酒精的渗透的一个初步的快速的改变中体现出来。较慢速的响应（Delta;C_slow）的体现来自于由于其更多的疏水成分和因此造成的一个滞后的反应而慢速渗透进入细胞的酒精溶液。由于这些测量结果都来自于相同的细胞，所有结果中还原石墨烯的表面覆盖也是完全相同的。不考虑测量的顺序（除了60%酒精往往是最后进行暴露其中的），从性质上说相同的实验结果也可以从其他还原石墨烯-钙-金体系细胞上观测到。在60%酒精溶液下细胞形态永久的变化与它的正常作为防腐剂这用途也相匹配。

结论

还原石墨烯-钙-金体系细胞的形成证明了还原石墨烯片与活性细胞的界面连接。片层在细胞表面形成了电子导通路径。使用金纳米颗粒包覆的钙离子作为生物相容性的一部分使得其与细胞交互界面形成。由于还原石墨烯片在厚度上是纳米级的，其模量也在1TPa级别上，它们在压应力下易于变形并形成折叠或者褶皱。细胞体积减少15%（图4e，由于横向5%的应力）将产生相当于22.5MPa的应力（细胞壁的体积模量常为150MPa）。这一应力将轻松地使还原石墨烯片起褶皱。使片层的大小为500nm的正方形（扫描电镜图像在支撑材料中），其厚度为1.5nm（还原石墨烯片的原子力显微镜图像在支撑材料中），计算这一应力褶皱的高度在约14nm左右。这一计算结果与观测得到的变形尺寸相匹配，原子力显微镜观测得到的细胞表面变形的观测尺寸约为10~25nm（图5c）。由于褶皱的形成而导致电导率的减少被用来观测应力冲击（暴露于酒精中）对酵母菌细胞造成的实时效果。可以观测到两个步骤：对于酒精的一个立即的反应以及一个更微小的逐步的响应。而且也可以观测到当增加酒精溶液的亲水性时细胞响应会更为迅速。

细胞与还原石墨烯片的交互界面也可以被扩大到伴随着其它细胞响应比如细胞生长或者离子通道动态学。通过还原石墨烯的信号转换可以归因于表面应力的改变或者由于离子诸如氢离子的流动而形成的化学电势的改变。关于还原石墨烯片在细胞活性上的影响的详细的研究将更深远地推进这一领域。细胞在FET器件上的例子表面了细胞保持着它们的生物电化学和生物电子的活动。由于还原石墨烯片不可渗透入细胞膜，对于缺少细胞壁的细胞，沉积的程度可以通过使用有确定的尺寸和浓度的还原石墨烯片控制（例如通过离心分离精炼）。这样可以在仍保有电导率及细胞活性的情况下限制包覆了还原石墨烯片的细胞表面面积。通过使用纯净的石墨烯替代化学还原的石墨烯片，设备的灵敏度可以进一步提升。然而这也需要溶液处理方法的发展以使得纯净的石墨烯沉积到细胞表面上去。化学还原石墨烯已被用于制造电化学传感器和通过细胞和聚合物侦测表面掺杂。使用氧化石墨烯的优势是由于它的良好的胶体稳定性和表面功能化，它可以被用于附着靶向分子并与细胞形成交互界面。细胞增殖也

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