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液相沉淀法制备纳米相锶、镁和锌取代羟磷灰石及其表征

Sophie C. Cox ^a , Parastoo Jamshidi ^b , Liam M. Grover ^b , Kajal K. Mallick ^a,*

a Warwick Manufacturing Group, University of Warwick, Coventry CV4 7AL, UK

b School of Chemical Engineering, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, UK

摘 要 本课题在20℃的碱性（pH=11）溶液中制备掺杂量分别为2mol%Sr，10mol%Mg和2mol%Zn的掺杂羟基磷灰石（HA）。通过X射线衍射（XRD）来观察材料的物相组成；通过红外光谱（FTIR）来观察在空气中制备的样品表面CO₂的吸附量；通过扫描电镜（SEM）观察到羟基磷灰石具有球形形态，并且有团聚行为；通过X射线能谱分析（EDS）观察Sr，Mg和Zn掺杂情况和组成成分。在目前的研究中，没有发现阳离子掺杂对颗粒形态有根本性的影响。通过干涉量度分析法和补充的SEM显微照片分析浸渍在SBF中长达28天的样品，可以获得样品潜在的体内生物活性的数据。此外，使用活/死测定法，表明了接种MC3T3的成骨细胞前体细胞在纯HA和掺杂HA的基底上可以生存7天以上。

关 键 词 生物陶瓷 掺杂羟基磷灰石 液相沉淀法 模拟体液 成骨细胞

1.介绍

磷酸钙类物质广泛存在于自然界中，并被广泛地用作生物材料，特别用于硬组织的修复和再生。在这类材料中，羟基磷灰石[(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂-(HA)]是最知名的，因为它的晶体结构和化学成分与硬组织的矿化成分相似^[1]。凭借这些特征推测HA具有优良的细胞相容性和骨传导性。但是，天然骨的磷灰石与化学计量HA在许多方面是不同的，包括非化学计量，纳米晶体尺寸（n-HA）等。当化学计量HA假定为100时，其相对结晶度为33-37^[2,3]。

生物磷灰石的非化学计量是由于外来离子掺入晶格或吸附在表面上导致的。通过磷灰石结构的灵活性证明了阳离子和阴离子取代的多样性^[4]。报告认为，当替代离子存在于天然硬组织中（如锶（Sr）、镁（Mg）和锌（Zn）进入CaPs中）时，能够优化生物材料在结构顺序（即结晶度）、 在化学溶剂中的溶解度、表面电荷和模拟生理条件下的溶解速率等方面的性能。这些性能也能反过来影响生物活性，从而引起了广大研究界中更多学者的兴趣^[1,2,5,6]。尤其是掺杂羟基磷灰石的表面提供了用于溶解和再沉淀的动态区域，可以观察出提高HA的降解性对于较少的结晶是有利的^[7-9]。

将天然存在的离子物质掺入如HA等磷酸钙类物质中，不仅改变了晶体结构的空间群、形态、热稳定性和机械性能，而且在骨细胞的生物反应中也起到了重要的作用^[10]。例如，Mg² 的减少与骨骼生长的停止、成骨细胞活性降低以及机械性能降低有关^[11-13]。所以Mg² 成为HA晶格取代时优先要考虑的元素。同样的Sr² 能够增加成骨细胞的数量，同时减少破骨细胞的数量和活性^[14-16]。这种效果在治疗骨质疏松症方面特别有益^[4,17]。Zn² 能够提升成骨细胞的活性，但是也具有降低骨密度和延性，导致骨折概率增加的缺陷^[19]。这些性能已经被证实和提出。本研究针对这些二价离子对磷酸钙类物质生物活性潜力的增强进行了系统的研究^[2,20-23]。

尽管已经有一些文章对这一领域进行了一定的研究，但是据我们所知，在相同实验条件下，Sr，Mg和Zn掺杂的HA的物理化学性质的系统性的表征和对比还没有人报道。阳离子掺杂对HA各种性能的影响的判断是否准确要看样品制备的条件是否相同。人们认为反应条件如pH和温度等，对判断HA生物学性能的影响参数有较大影响。因此，控制这些反应条件对于研究目标阳离子对HA的影响是至关重要的。

本项目在20℃的碱性（pH=11）溶液中，使用液相沉淀法合成了含有2mol%Sr，10mol%Mg或2mol%Zn的HA。通过X射线衍射仪（XRD），扫描电子显微镜（SEM），光电子能谱（EDS），差热-热重分析仪（DTA- TGA）和傅里叶透射红外光谱（FTIR）测定物相，结晶度，粒子形态，离子取代程度和热稳定性。通过进行长达28天的模拟体液（SBF）研究，获得取代样品的生物活性的数据（根据ISO 23317:2007）。此外，进行活/死测定来比较接种在纯HA和掺杂HA底物上培养的MC3T3成骨细胞前体细胞的活力状态。

2.实验

通过液相沉淀法，在20℃的碱性（pH=11）溶液的条件下合成纯HA的对照样品和掺量为2mol%Sr，10mol%Mg和2mol%Zn掺杂的HA。Sr² ，Mg² 和Zn² 用于取代HA晶格中的Ca^{2 [2,24,25]}。为了比较最终产品，Ca/P或（Ca M）/P（其中M = Sr，Mg或Zn）的实验比例维持在1.67。除非另有说明，否则所有试剂没有经过进一步纯化就可以使用，这些试剂购自Sigma Aldrich（UK）。

2.1.液相沉淀法制备纯HA和掺杂HA

将0.03M磷酸氢二铵[(NH₄)₂HPO₄ge;98.0%]溶解在去离子（DI）水中制备出P0₄^3-备用溶液。将0.05M四水合硝酸钙[Ca(NO₃)₂·4H₂Oge;99.0%]溶解在去离子水中制备出Ca² 备用溶液。为了制备出Sr，Mg或Zn掺杂的HA，调节硝酸钙的量以配合2mol%Sr，10mol%Mg和2mol%Zn的掺杂。然后溶解适量的硝酸锶（Sr(NO₃)₂ge;99.0%），硝酸镁（Mg(NO₃)₂ge;99.0%—Johnson Matthey，UK），或六水合硝酸锌（Zn(NO₃)₂·6H₂Oge;98.0%）于含有Ca² 的溶液中。持续搅拌直到固体完全溶解，溶液混合均匀。使用pH计（pHTestr10，Eutech Instruments，USA）测量溶液的pH，并使用适量的氢氧化铵（NH₄OH 28.0-30.0%）溶液将pH调整至11plusmn;0.1。使用滴定管将PO₄^3-溶液逐滴加入到上述溶液中，同时在400rpm下搅拌，保持pH在11plusmn;0.1。把最终得到的溶液在室温（20℃）下搅拌1.5小时。过滤，使形成的沉淀从上层清液中分离出来，用去离子水洗涤沉淀，干燥，最后研磨成微粉化的粉末。

为了利用存在于大气中的CO₂制备天然碳酸化的HA，上述步骤在空气中进行。与其他条件的研究相反^[26,27]，由于碳酸盐掺杂进入HA结构没有得到准确控制，因此认为产物不属于碳酸化的HA（CHA）。

2.2.体外分析

在掺杂的HA样品的底物上进行测试，并用在相同的实验条件下合成的纯HA样品来做对照。

2.2.1.颗粒制备

使用Simplemet 2压机（Buehler，UK），对0.25plusmn;0.02g合成出来的粉末施加800N的平均单轴力，将每个样品压制成10mm的颗粒。为了降低整体孔隙率，以1℃/min的恒定升温速率加热至600℃对颗粒进行气氛烧结，在600℃下保温1小时，然后以1℃/ min的速率冷却。通过XRD表征烧结前后粉末的物相，确保没有发生物相变化。

2.2.2.模拟人体体液测试

经检测SBF溶液中的离子浓度与人血浆中的离子浓度几乎相同。生物材料潜在的体内生物活性可以通过浸泡在SBF中，材料表面形成磷灰石的能力来表征。

SBF溶液根据ISO 23317：2007的标准，使用Kokubo等^[28]人提出的方法制备。将几种吸湿试剂0.224g氯化钾（KClge;99.0%），0.305g六水合氯化镁（MgCl₂· 6H₂Oge;99.0%），0.278g氯化钙（CaCl₂ge;93.0%）和0.071g硫酸钠（Na₂SO₄ge;99.0%）快速加入到溶液中。在加入CaCl₂时，先将CaCl₂溶解在25ml去离子水中（包括洗涤用水）再加入到溶液中。制备的整个过程中，溶液温度保持在36.5plusmn;1.5℃，并以200rpm持续搅拌。

将每个样品的四个颗粒浸入SBF中，使溶液覆盖整个样品表面，置于37℃的培养箱中。浸泡时长为1、7、14、28天时分别取出一个颗粒，干燥后进行分析。

2.2.3.细胞培养

在培养1、3、5和7天后，使用活/死活细胞/细胞毒性试剂盒分析MC3T3成骨细胞前体细胞的活力。最终细胞密度为2times;10⁴，将细胞直接接种在预先用1.5mL Sylgard 184型硅氧烷弹性体（Dow Corning Corporation，Midland，MI）包被的24孔多孔板中的颗粒表面上。 使用Calcein-AM和碘化丙啶（1mg / mL；Molecular Probes，Invitrogen，UK）在黑暗中分别对活细胞和死细胞进行染色。

2.3.材料表征

使用基于布拉格—布伦塔诺（Bragg-Brentano）几何的Bruker D5000 X射线衍射仪中单色Cu K_alpha;照射样品（lambda;= 1.54056 Aring;）来分析合成样品的物相和结晶程度。使用铝样品架，每次测量的角度为5~70°，步长为0.02°，计数时间为15s。按照粉末衍射标准联合委员会（JCPDS）的参考文件来设定检测模式。使用Scherrer方程（式（1））从HA的（002）峰的线宽中获得微晶尺寸的估算值：

L=K lambda;/B cos theta; （1）

其中L=微晶尺寸，K=与晶体习性有关的Scherrer常数（0.9），lambda;=X射线波长，B=半峰强度峰值宽度（以弧度表示），theta;=布拉格角。

通过Zeiss Supra55 FEGSEM研究颗粒的大小和形态。通过能量色散分光镜（X-max 50mm²，Oxford Instruments，UK）对含有Sr，Mg或Zn的样品进行元素组成的定性和定量分析。

使用Spectrum One FTIR光谱仪（PerkinElmer，UK）进行FTIR测试，观察干燥粉末的化学吸收特性。对于每个谱图，在4000和550cm^-1之间产生8次吸收峰。

使用装有配套STARe软件的TGA / DSC-1 STARe仪器（Mettler-Toledo，UK），同时进行DTA-TGA，对掺杂HA粉末和对照纯HA样品的进行热分析。取10plusmn;0.05mg样品放入氧化铝坩埚，在空气中以20℃/min的恒定速率从30℃加热至1300℃。

用SEM和EDS表征浸泡在SBF中的颗粒表面上磷灰石的潜在增长。此外，使用NT2000干涉仪（Wyco，UK）对颗粒表面的平均粗糙度（R_a）进行定量分析。使用装有汞灯（Carl Zeiss Ltd，Hertfordshire，UK）的荧光显微镜在times;20的倍率下观察颗粒表面上培养的细胞。

3.结果

3.1.晶体结构

表3列出了使用XRD和Scherrer方程（式（1））计算分析的所有样品的物相纯度和平均微晶尺寸的结果。结果表明，所有样品的数据与合成HA的标准JCPDS参考（09-432）文件一致。没有鉴别出其它次生相，如黄铁矿或褐铁矿，表明获得的产物是纯相的。图1显示了所有样品的特征峰。此外，对SBF测试所用的颗粒进行XRD分析，证实了采用烧结方案时不会发生相变。还可以观察到烧结后颗粒的XRD图谱峰的锐度增加，可能与热处理引起的结晶度的增加有关。

3.2.微观结构发展

表4总结了颗粒和附聚物的平均尺寸，并列出了通过SEM观察到的典型颗粒形态。如图2所示，纯HA和掺杂HA样品的形态都是球状的，没有明显的差异。

3.3.分子结构

通过FTIR测定了包括羟基、磷酸酯和碳酸酯在内的主要官能团。根据Panda等和Koutsopoulos等^[29,30]的研究，观察到的碳酸化HA的振动频率和相应的带分布总结在表5中。与预期的相同，由于样品制备在空气中进行，在所有的FTIR光谱中都能观察到在1250和1520cm^-1之间有一个宽带，这个宽带的形成与

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