摘 要

Insulin是I型糖尿病人需要长期注射的主要药物，然而由于Insulin在体内异常折叠和纤维化会造成注射部位形成淀粉样纤维化病变。本文受传统中药大多来源于天然植物的启发，将天然植物提取物（包括：菊苣酸、环黄芪醇、黄芪甲苷和黄芩素）引入到抑制Insulin纤维化聚集的研究中，用标准的ThT荧光标记法分别探索了四种提取物对Insulin纤维化聚集动力学的影响，发现当Insulin与提取物浓度比达到1: 10时，四种提取物都对Insulin的纤维化有一定抑制效果。本文进一步采用圆二色谱仪（CD）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）研究了菊苣酸对Insulin构象转变、聚集形貌以及粒径变化的影响。本研究为天然植物提取物用于蛋白质构象病的治疗提供了新的思路并积累了基础研究数据。

关键词：Insulin；纤维化；天然提取物

Abstract

Insulin is the main drug for type I diabetics. However, due to abnormal folding and fibrosis in the body, it can cause amyloidosis in the injection site. Inspired by traditional Chinese medicine (TCM) mostly coming from natural plant, the natural plant extracts (including: chicory acid, cycloastragenol, astragaloside IV and baicalein) were introduced to inhibition study of insulin fibrosis in this article. Using standard ThT fluorescence labeling method respectively explored the influence of four extracts on the kinetics of insulin fibrosis, found that when the concentration of insulin and extracts was with ratio of 1:10, four kinds of extracts has certain inhibition effect on insulin fibrosis. Circular dichroism(CD), atomic force microscope (AFM) and dynamic light scattering (DLS) were further adopted to determine the effects of chicory acid on the conformational transformation, aggregation morphology and particle size of insulin. This study not only provides a novel insight for natural plant extracts serving as the treatment of protein conformational diseases, but also accumulates basic research data for further research.

Key Words：Insulin；Fibrillation；Natural extract

目 录

第一章 绪论 1

1.1蛋白质淀粉样变性与构象病 1

1.2 Insulin及其纤维化 2

1.2.1 Insulin简介 2

1.2.2 Insulin纤维化与糖尿病 3

1.3 Insulin纤维化抑制剂研究现状 4

1.3.1小分子抑制剂 4

1.3.2肽抑制剂 5

1.3.3异源蛋白抑制剂 6

1.4四种天然植物提取物 7

1.4.1菊苣酸 7

1.4.2环黄芪醇 8

1.4.3黄芪甲苷 8

1.4.4黄芩素 9

1.5淀粉样纤维研究方法 9

1.6本课题的研究目的与研究内容 10

第二章 实验部分 12

2.1实验仪器与材料 12

2.1.1实验仪器 12

2.1.2实验材料与药品 12

2.1.3溶液配制 12

2.2实验方法 13

2.2.1 ThT荧光标记法监控蛋白纤维化动力学 13

2.2.2原子力显微镜观测Insulin纤维形貌 13

2.2.3圆二色谱检测Insulin纤维化过程中的构象转变 13

2.2.4动态光散射检测Insulin纤维生长过程中的粒径变化 14

第三章 结果与讨论 15

3.1不同浓度的Insulin纤维化的生长曲线 15

3.2四种天然植物提取物对Insulin纤维化动力学的影响 15

3.3菊苣酸对Insulin纤维形貌的影响 17

3.4菊苣酸对Insulin构象转变的影响 18

3.5菊苣酸对Insulin纤维粒径的影响 20

结 论 22

参考文献 23

致 谢 26

第一章 绪论

1.1蛋白质淀粉样变性与构象病

蛋白质是一种有机大分子，是由多种氨基酸脱水缩合组成的多肽链通过盘曲折叠形成的具有一定空间结构、承担各种生命活动以及构成生物组成体所不可或缺的物质。为了保持活性，蛋白质必须保持在对应热力学最稳定状态的折叠构型。在它们承担各项生命活动的任务或者自身生长过程中，会遇到一些极端条件或者突发情况，如病毒、各种酶、温度、酸碱度等机体自身或外界的影响，使得蛋白质原本稳定的构型发生转变，由原本稳定的无细胞毒性的α-螺旋构型或无序结构转变为β-折叠构型，这种β-折叠结构，有着链内平行于纤维轴的氧键，因此片层之间的相互作用力总是小于片层内氢键的作用力，可以使得蛋白质丧失各种生理功能，具有非常明显的细胞毒性，这样一个过程称之为蛋白质纤维化或者淀粉样沉积。1854年，德国的科学家Rudolph Virchowa发现在细胞质中发现了一些沉积物，没有固定的形态，他用碘对含有这些沉积物的病理组织进行染色，发现呈现淡蓝色，随后加入硫酸蓝色加深，为了与普通的淀粉遇碘变蓝现象进行区分，他将这一沉积物命名为淀粉样沉积，这便是蛋白质淀粉样沉积首次出现在人们的认知中。随着科技手段以及研究的发展和深入，人们发现这种淀粉样沉积的本质就是蛋白质沉积，而非碳水化合物或者脂肪等生命体中含量同样很多的其他物质。

目前存在争议的蛋白质纤维形成机制中，被较为广泛认可的主要是核依赖聚集机制。蛋白质在特定的条件下，原有的结构不再稳定，首先形成了小的集合体，它们相互作用结合，形成了初始纤维核，即蛋白质纤维化过程的成核阶段（延滞期），然后以其为核心与蛋白质单体聚合，形成原纤维，进一步形成成熟纤维。成核阶段形成的原纤维数量很少，但它起到了促进生长期纤维形成的重要作用，当大多数蛋白均形成纤维时，整个过程就达到了平衡。但是蛋白质聚集有一个最低浓度限度，低于这个临界浓度将不会发生蛋白质纤维化。通常情况下，展开的或者聚集了的蛋白会经由细胞分泌的蛋白酶作用而裂解并排出细胞，但是纤维化后的蛋白质通常会产生对这些酶的抵抗作用，难以分解并排出细胞，这是由于蛋白质纤维化过程中，通常会伴随疏水基团、二硫键、巯基暴露，与细胞膜或者细胞器上的蛋白通过二硫键结合，从而使得纤维化的蛋白沉积在细胞膜和细胞器上，使得细胞正常生理活动难以进行从而造成细胞毒性。同时，蛋白质的纤维化过程中会形成各种形态不一、大小不同的聚集体，如二聚体、纤维核、寡聚体、原纤维等等，是相当复杂的一个过程，目前对于纤维化危害产生的真正原因仍然存在争议，但是蛋白质淀粉样纤维化对机体有着严重损害是毋庸置疑的，因此研究者们对其形成机理、危害产生的原因以及对蛋白质纤维化的抑制进行了广泛而深入的研究。

目前已知的与蛋白质淀粉样纤维相关的疾病已经超过40种，其中典型的就是阿尔兹海默病、帕金森、疯牛病、二型糖尿病等。在人类与疾病的抗争史中，这些疾病让无数人经历着苦痛，而治疗方法却十分有限，这让研究者们有了研究并征服蛋白质纤维化的动力与决心。表1.1所列的是部分与蛋白质纤维化过程相关的疾病以及相应蛋白。

表1.1 部分与淀粉样蛋白相关的疾病以及相应前体蛋白和淀粉样纤维蛋白

1.2 Insulin及其纤维化

1.2.1 Insulin简介

Insulin是一种由胰岛B细胞分泌的以α螺旋结构为主的由51个氨基酸组成的天然蛋白质，分为A、B两个肽链，其中A7(Cys)与B7(Cys)，A20(Cys)与B19(Cys)四个半胱氨酸通过巯基形成两个二硫键连接了A、B两链，此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。A链有A2-A8以及A13-A20两个螺旋段；B链有一个展开段B1-B8，在α螺旋区B9-B19和B20-B23之间是一个β转角，B24-B28则是又一个展开区。但不同种动物Insulin组成略有不同，如图1.-1所示。

作为机体内唯一能够降低血糖以及促进糖原、脂肪和蛋白质合成的激素，Insulin对于人体的重要性不言而喻。Insulin参与调节糖代谢、脂肪代谢以及蛋白质代谢等生命活动，是维持机体平衡的“守卫”之一。当体内Insulin分泌不足或者缺少Insulin受体时，血糖升高，超过肾糖阈值，产生糖尿，即人们常说的糖尿病。当体内糖分过高，会引起身体各方面的病变，如高血压、视网膜病变、冠心病等糖尿病并发症。而当体内Insulin含量过高，血糖含量骤降，会引起头晕昏厥甚至休克，即低血糖。由此可见，体内Insulin的平衡的含量对于机体正常的生命活动的关键性作用。

图1.1 Insulin结构示意图

1.2.2 Insulin纤维化与糖尿病

在典型的与淀粉样纤维病变有关的疾病中，I型糖尿病是关注度以及患病率都非常高的一种，Insulin的错误折叠与纤维化聚集易导致在患者长期注射的身体部位形成淀粉样纤维病变，造成肌肉损伤以及其他不良反应；同时，在Insulin药品保存和运输过程中的纤维化会导致其失去活性甚至注射后对患者有危害。Insulin作为一种成纤维条件已经很成熟的蛋白（pH=2，60℃培养3~5日），分子量较小，加上其简单的一级结构，被常用于淀粉样纤维病变的研究中。Insulin在不同的条件下可能形成纤维结构，如高温、低pH、低浓度变性剂等，而它纤维化的关键就在于其二级结构由α-螺旋构型转变为β-折叠构型。Insulin由天然的低聚物形式解离成单体是其纤维化过程中极其重要的一环，单体随后部分展开并聚集形成纤维，其纤维化过程中Insulin存在的形态会有多种并且不定，甚至来源相同批次不一样的Insulin在纤维化过程中也会显示出差异性

Insulin的纤维化过程会受到离子强度、外界温度、溶液pH、粘度等因素的影响。Insulin注射是糖尿病人治疗时的必须手段，而其作为药物，由于二聚体和单体等形态不够稳定，易发生聚集，因此在贬存和注射时使用的一般是加入了有抑制聚合效果的金属离子的Insulin六聚体，使得药物更加稳定。同时，为了延长Insulin在体内的持续时间，提高患者注射的Insulin降血糖效果，将Insulin与鱼精蛋白结合或者复合氯化锌，可获得长效Insulin。

Insulin的纤维化过程会经历不同尺寸的生长聚集阶段。Insulin低聚物解离成部分展开的单体，当这部分中间产物浓度达到临界值，成核期就开始了。即单体的部分展开诱发了相关过程。2004年，有学者提出InsulinA、B链上无序结构部分的疏水基团的暴露可能是单体自组装的原因。B链上无序的部分展开的羧基端打开了B24-B26的疏水芳香基团，这些部分进一步形成了纤维核的β折叠结构。然而由于纤维核只是在纤维化过程中一种暂时的中间产物，因此确定其尺寸很困难。科学家们通过各种生物物理手段对纤维核进行测定，以聚集动力学为基础，发现由于蛋白氨基酸序列或者环境条件不同，形成的纤维核的尺寸和形态都有所差异，在不同条件下，Insulin可以以六聚体、四聚体、三聚体或者单体等不同形式存在。研究学者通过x射线衍射，电子显微镜，原子力显微镜，以及固态核磁共振和电磁谐振等生物物理方法研究了Insulin纤维的结构，呈现长、直、无分支装状的网状纤维，这些纤维由更小的淀粉样纤维的亚结构——原纤维组成。原纤维的数量取决于前体蛋白，彼此之间通过扭曲缠绕形成成熟纤维。通过X射线衍射测试，发现Insulin淀粉样原纤维的内部结构是典型的β折叠形式，纤维分子共享一个氢键平行于纤维轴的β折叠结构为主的核心，像梯子一样。

1.3 Insulin纤维化抑制剂研究现状

目前人们已经发现有多种物质对于Insulin的纤维化有着抑制作用。最开始采用的抑制方法主要是为了促进Insulin的自组装。Insulin必须分解成单体才可以开始纤维化，而Zn² 或者Ca² 的加入可以稳定Insulin的六聚体结构，促进Insulin自组装，从而阻止了纤维化的开始。部分多羟基化合物，如两亲性嵌段共聚物、甘油、碳水化合物等，通过在Insulin表面形成一层保护膜阻止了水进入疏水内核同时减少了不必要的疏水作用，从而阻碍了纤维化进行。而甜菜碱、海藻糖、瓜氨酸等也抑制剂也是类似机理。目前常用来作为Insulin抑制剂的物质主要有小分子以及多肽和异源蛋白，此小节将对三类物质作为纤维化抑制剂的研究进行综述。

1.3.1小分子抑制剂

迄今为止，人们已经发现多种小分子化合物可以作为Insulin纤维化的抑制剂，如芳香族化合物、氟代醇、金属配合物、两亲表面活性剂以及纳米粒子等。其中最为广泛研究的是芳香族化合物。一般具有两个及以上苯环以及苯环上多羟基的物质会有较强的抑制作用，这是因为多苯环使得它本身疏水性增强，加上苯环的堆积作用，可以让这些小分子化合物更容易与蛋白结合，它们的结构同时具备识别与抑制效果。在这些芳香族化合物中，最为典型且研究最为广泛的是黄酮类化合物，几乎存在于所有绿色植物中。一般是指两个苯环通过三个碳原子连接而成的一系列化合物，绝大多数含有多个羟基。Malisauskas R和Botyriute A对市场上已有的265种黄酮衍生物进行了Insulin纤维化抑制效果的研究，确定了苯环上羟基位置在抑制纤维化过程中的重要作用，在5、6、7以及4’号位上的羟基具有很强的抑制作用，而3号位上的羟基则应该尽量避免，具有相反作用。银杏提取物中含有大量黄酮类化合物，作为应用最为广泛的植物提取物之一，在Insulin纤维化的抑制研究中，同样得到了应用。严向阳、曾成鸣等发现银杏叶提取物EGb761可以抑制Insulin成熟纤维的形成，同时避免由纤维化诱导产生的红细胞聚集和溶血现象。由于EGb761中富含的多酚结构化合物可能通过分子间的氢键作用、苯环间π-π键作用以及疏水作用对β折叠结构造成破坏，从而抑制了纤维化进行。另一方面，多酚类化合物也是抑制蛋白纤维化的重要组分之一，其抑制效果可能与它们的抗氧化作用有关，因为纤维化过程被证明可能与自由基历程密切相关。由于蛋白纤维化过程离不开其表面疏水性的增强，因此通过减小表面的疏水性是抑制纤维化的一个重要手段。陈云霞等发现一定浓度的硫酸钠通过减小Insulin聚集体表面疏水性达到了较为明显的抑制纤维化效果。金属螯合物的加入则是通过稳定Insulin六聚体结构，使其难以分离形成单体，从而阻断了纤维化的开始来实现抑制作用的。

目前的药物主要采用小分子化合物，这是由于它们更易代谢，具有良好的生物利用度，易于被人体吸收，因此小分子抑制剂仍旧是目前研究的重点，前景远大。但是，它们也有着不可忽视的缺点，由于六聚体形态的Insulin体积较大，在血液中难以运输来实现蛋白质各项生理功能，所以体内常常要以单体或者二聚体形式存在，而金属螯合物小分子的加入则会影响这些功能活性，造成体内代谢紊乱。而多羟基化合物需要较高的浓度才能实现良好的抑制效果，同样可能引起不必要的的免疫反应。总之，对于小分子化合物抑制剂的研究仍然需要更进一步。

1.3.2肽抑制剂

除了众所周知的小分子抑制剂，肽作为纤维化抑制剂中最具有发展潜力的一员，受到了广泛关注与深入研究。由于肽本身属于蛋白水解的中间产物，因此它们具有更好的生物相容性，不易引起体内的免疫反应造成不必要的机体损伤，副作用低。肽抑制剂可以通过设计，将对β折叠结构形成有着抑制作用的氨基酸序列或者有关基团连接到对相应蛋白有特异性识别作用的序列上，形成同时具有特异性导向和抑制效果的多肽链，达到一举两得的目的。

TJ Gibson和RM Murphy 将能够与Insulin上B12-B17特异性识别的短肽VEALYL结合到对Insulin纤维化有着抑制作用的六甲精氨酸上，明显降低了Insulin聚集的速度，阻碍了纤维化进程。谷胱甘肽是由甘氨酸、半胱氨酸以及谷氨酸组成的三肽，李红红等通过硫黄素（ThT）荧光检测Insulin纤维化的动力学曲线以及用8-苯胺-1-萘磺酸测定其表面疏水性变化，确定谷胱甘肽对于Insulin纤维化有抑制作用，这与其分子内的巯基密切相关，降低了Insulin聚集体表面疏水性。由于肽具有巯基，通过巯基与蛋白质的二硫键作用，改变了纤维聚集形式，减少Insulin进一步聚集的可能。此外，单纯的氨基酸对于Insulin纤维化的抑制也有报道，这些都离不开巯基的作用。另一方面，Insulin纤维化与螺旋状B链上带电的羧基端的打开和氨基端的展开有一定联系，意味着静电相互作用和疏水作用与一过程有密切相关。Mishra N K等研究了几种肽序列对Insulin纤维化的影响，发现当肽为疏水肽且疏水作用更强时，抑制效果更好。尽管肽作为抑制剂有着各种各样的优点，但是在水解条件下的稳定性是限制其发展的亟待解决的一大缺陷，在蛋白水解条件下，肽链可能分解成原有氨基酸，失去设计的功能。为了打破这一局限，肽作为抑制剂的研究将更加深入，其应用前景仍旧被大肆看好。

1.3.3异源蛋白抑制剂

在蛋白质纤维化抑制剂的研究中，最大的难题及挑战就是在有效抑制纤维化的同时，保持蛋白质的功能活性。目前大部分抑制剂在活性位点与蛋白质结合后，会在一定程度上降低蛋白原本的功能活性，而异源蛋白抑制剂则可以避免影响到活性，在这种情况下应运而生。Insulin和胰淀素（IAPP）同为胰岛B细胞分泌的蛋白，胰淀素被发现可能会在体内聚集，这可能与二型糖尿病有关。人们发现Insulin与胰淀素之间存在着较强的相互作用，猜测两者之间也许会抑制彼此的纤维化。Velkova用阻断了胰淀素自组装作用的无毒非淀粉样胰淀素类似物IAPP-GI对Insulin纤维化的抑制进行研究，发现它可以完全阻断Insulin寡聚体的形成，大大降低这一过程的毒性，同时对于Insulin的功能活性没有影响。溶菌酶以及牛血清白蛋白抑制了Insulin纤维的形成，降低了细胞毒性并改变了表面的疏水性。这可能与降低了Insulin分子本身的扩散速度，使得Insulin蛋白聚集的概率减小，局部难以达到纤维化条件有关。异源蛋白抑制剂对于原有蛋白的活性影响小，但是需要考虑在体内环境下的共存问题，对于体内系统的稳定可能存在一定影响。另一方面，蛋白本身的大分子结构难以吸收，体内实现效果难以实现，因此，研究异源蛋白的抑制效果还需进一步考虑和发展。

1.4四种天然植物提取物

本文拟探究菊苣酸、环黄芪醇、黄芪甲苷以及黄芩素四种天然植物提取物对Insulin纤维化过程的影响。目前，已有众多关于天然植物提取物对蛋白纤维化抑制的研究，Kachooei E的研究显示天然提取物紫杉醇能够显著地阻碍成核，从而抑制Insulin的纤维化，且这一过程与剂量密切相关；Lobbens E S, Foderà V通过芦荟素与Insulin的相互作用研究得出天然提取物对蛋白质纤维化的抑制作用是源于其降解产物而非提取物本身。天然提取物对蛋白质纤维化的抑制作用与其疏水性和抗氧化作用密切相关。同时，天然提取物具有来源广，成分安全等优点，研究不同提取物对纤维化作用的影响对于药物制备合成具有重要意义，也能对蛋白质稳定剂提供新的选择。

1.4.1菊苣酸

菊苣酸是是一种具有多种异构体（L-菊苣酸，D-菊苣酸，内消旋菊苣酸以及外消旋菊苣酸等）的咖啡酸衍生物，其构型与原材料种类有关，结构式如图1.2所示。目前已有的研究证明，菊苣酸可以有效抑制由微生物、病毒等分泌的透明质酸酶的分解作用，阻止微生物等释放的毒素扩散，从而达到良好的消炎抗炎作用。此外，菊苣酸还可以通过刺激巨噬细胞产生免疫活性因子，具有免疫调节、抗菌抗病毒活性。另一方面，由于菊苣酸属于天然多酚类化合物，具有极其优异的抗氧化能力，可以清除自由基、延缓衰老、预防治疗氧化应激相关疾病等。Yutang Wang等研究发现菊苣酸通过促进Keap1 / Nrf2活性并加强抗氧化防御酶的表达，调节应激信号通路来达到治疗神经性损伤和认知功能障碍的作用。它被认为可以有效缓解氧化应激作用，在治疗神经退行性疾病上有着巨大的潜力。有研究证明，菊苣酸可以促进胰岛B细胞分泌Insulin，对于糖尿病具有一定治疗作用。

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