摘 要

Amylin蛋白的错误折叠和异常纤维化是二型糖尿病基本病理特征。研发抑制Amylin错误折叠和纤维化的药物是治疗二型糖尿病的重要途径。本文受传统中药大多来源于天然植物的启发，将天然植物提取物（包括：菊苣酸、环黄芪醇、黄芪甲苷和黄芩素）引入到抑制Amylin纤维化聚集的研究中，用标准的ThT荧光标记法分别探索了四种提取物对Amylin纤维化聚集动力学的影响，发现四种提取物都对Amylin的纤维化有一定抑制效果，且该抑制效果受提取物浓度的影响，其中菊苣酸抑制Amylin纤维化的起效浓度最低（菊苣酸 : Amylin = 1:1）。本文进一步采用CD、AFM和DLS研究了菊苣酸对Amylin构象转变、聚集形貌以及粒径变化的影响。本研究为二型糖尿病的治疗提供了新的思路并积累了基础研究数据。

关键词：Amylin；二型糖尿病；天然植物提取物；纤维化抑制

Abstract

Misfolding and abnormal fibrosis of Amylin protein are the basic pathological features of type 2 diabetes. Developing an agent that inhibits Amylin misfolding and fibrosis is an important route for the treatment of type 2 diabetes. Inspired by the fact that most of the traditional Chinese medicines are derived from natural plants, natural plant extracts (including chicory acid, cyclosporin, astragaloside and baicalein) were introduced into the study to inhibit fibrotic aggregation of Amylin. The effects of four extracts on Amylin fibrillation and aggregation kinetics were explored. The results showed that four extracts had inhibitory effect on Amylin fibrosis, and the inhibitory effect was affected by the concentration of extract. Among them, Amylin fibrosis had the lowest onset of action (Cichoric acid: Amylin = 1: 1). In this paper, the effects of chicory acid on the conformational transition, aggregation morphology and particle size of Amylin were further studied by using CD, AFM and DLS. This study provides a new idea for the treatment of type 2 diabetes and accumulated basic research data.

Key Words：Amylin；Type 2 diabetes；natural plant extract；inhibitor of fibrillation

目 录

第一章 绪论 1

1.1糖尿病与Amylin 1

1.2淀粉样蛋白沉积 2

1.3天然的糖尿病治疗物质 3

1.3.1黄芩素 3

1.3.2黄芪提取物 4

1.3.3菊苣酸 4

1.4蛋白质体外动力学监测及表征 5

1.4.1圆二色谱检测 5

1.4.2 ThT荧光光谱检测 6

1.4.3原子力显微镜 6

1.5研究目的 6

第二章 四种天然植物提取物对Amylin蛋白的纤维化过程的抑制作用 7

2.1前言 7

2.2实验部分 7

2.2.1主要实验试剂和仪器 7

2.2.2测试方法 8

2.3实验结果与讨论 9

2.3.1 ThT荧光光谱 9

2.3.2 Amylin构象转变检测 12

2.3.3动态光散射监测粒径变化 14

2.3.4原子力显微镜扫描Amylin培育后形貌 15

第三章 结论 16

参考文献 17

致 谢 19

第一章 绪论

1.1糖尿病与Amylin

糖尿病已经成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病，对全球的医疗卫生保障体系造成了巨大的负担^[1]。目前全世界约有1.5亿糖尿病的患者，预计到2025年这个数字将增加至3亿。而糖尿病在中国的严峻形势更是发人深省，如今年中国已经成为糖尿病第二大国。根据糖尿病的发病机理，目前主要分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病两种，其中二型糖尿病患者占糖尿病总患者数的90%以上^[2]。一型糖尿病成因复杂，主要有遗传因素，病毒感染，自身免疫系统缺陷或者多种因素共同作用产生，患者体内胰岛素分泌功能障碍，体内胰岛素低于正常水平，属于终身胰岛素依赖性糖尿病，患者需要靠注射人工胰岛素进行治疗。二型糖尿病则是由于病人体内胰岛素相对匮乏而产生的，有的患者体内胰岛素生产正常甚至高于正常水平但由于胰岛素敏感性低而导致出现体内血糖代谢问题，目前二型糖尿病的具体发病原因尚未明确，饮食，遗传等因素都可能诱发二型糖尿病^[3]。

早在1901年，Opre就在糖尿病患者的胰岛内发现了淀粉样蛋白，在1987年的时候，Westemark发现淀粉样蛋白的主要成分是一种来自于人体胰岛β细胞的蛋白，称为Amylin，随着后续研究的跟进人们开始逐渐意识到Amylin与人类二型糖尿病之间有着紧密的联系。Amylin是一种由37个氨基酸构成的肽链，在人体中有着至关重要的作用。Amylin是人类在胰岛中发现的第三种激素，是由37个氨基酸组成的多肽链，主要是对胰岛素起着负相关的调控作用，对于调解血糖水平和一些相关生理机能有着十分重要的作用^[4]。研究表明，Amylin中的特定氨基酸序列（22-27，23-27和20-29）能形成β折叠，这是形成淀粉样沉淀的必要因素。与其他人体内激素一样，Amylin也是一个多效激素，参与了人体的代谢过程。目前已经确定的功能有促进生长，发育；维持血糖的稳定；活化血管；痛觉感受等，多效性使得Amylin在人体生命活动中扮演着十分重要的角色。相关医学研究指出，95%以上2型糖尿病人的胰岛中有着明显的Amylin淀粉样沉积情况，而转基因鼠的实验则得出，人Amylin基因的过度表达导致了细胞间的Amylin淀粉样沉积，从而引发血糖比例失调的症状。目前我们已经将胰岛中淀粉样蛋白沉积和胰岛β细胞团减少作为二型糖尿病的主要病理表现，为治疗提供诊断依据。

1.2淀粉样蛋白沉积

蛋白质是由氨基酸按照一定的序列联结在一起后具有一定空间结构的生物大分子，是生物体内的一种承担多种生物功能的活性大分子，是生物主要生命活动的承担者，是一切生物的基础。按照蛋白的结构层次的不同，我们将蛋白质分为一级结构，以及在三维空间尺度上的二级结构，三级结构和四级结构。其中一级结构是组成蛋白质的氨基酸序列，而二级结构，三级结构，四级结构则是针对蛋白质的具体空间构型，空间构型对蛋白的生物活性有着至关重要的作用，是生命活动的基础。但是正是由于其复杂的空间构型，蛋白质容易产生一些构型改变甚至相互之间的联结,从而影响蛋白质正常的生物功能。蛋白质在形成中间体或者低聚体时，会形成一种α螺旋结构，是纤维化抑制剂的作用目标，也是我们进行蛋白结构检测的荧光染料作用位点。同种蛋白会因为自身的错误折叠而相互联结，形成一些蛋白质的淀粉样沉积，这样的蛋白质淀粉样沉淀对人体不仅不能承担正常的生物功能，而且还会造成一些疾病危害人类的健康^[5]。目前有记载得由于淀粉样蛋白导致的的疾病已经超过20种，如由于Aβ蛋白与tau蛋白的淀粉样沉积会导致阿兹海默症（老年痴呆）^[6]，突触核蛋白的淀粉样沉积会导致帕金森综合征^[7]，polyQ蛋白的淀粉样沉积会导致亨廷顿病（舞蹈症）^[8]以及Amylin蛋白的淀粉样沉积^[9]是产生二型糖尿病的诱因。相关研究表明^[10]，由于Amylin局部分泌水平异常会导致Amylin的大量沉积形成寡聚体，这些寡聚体会沉积在胰岛内从而抑制胰岛素的分泌，造成人体血糖紊乱。除了抑制胰岛素分泌以外，这些淀粉样蛋白沉积还会导致胰岛β细胞功能障碍对细胞造成损害，临床上表现为Amylin淀粉样蛋白沉淀程度与二型糖尿病的严重程度成正比。Amylin低聚体对于胰岛β细胞具有很强的细胞毒性，会促进胰岛β细胞的凋亡，当凋亡速率大于更新速率的时候，胰岛β细胞数量开始减少，进而进一步对人体造成危害。目前有很多研究都表明，Amylin在寡聚体状态即非可溶性纤维蛋白聚集的过程中的小聚集体状态，是促进二型糖尿病发生发展的一个重要因素。由于Amylin淀粉样沉积导致的胰岛β细胞功能障碍，胰岛素的分泌情况受到影响，直接表现为人体的血糖含量升高，而胰岛素在人体中又承担着许多生命信号传递因子的功能，会对包括脑功能在内的生理机能造成损害^[11]，因此有相关学者将二型糖尿病的发病导致阿兹海默病等疾病的发生，引发脑功能障碍^[12]。正是因为Amylin的多功能性和在生物体中的重要性，Amylin的纤维化沉积研究意义十分深远，从生物体内化学信号角度，控制其毒性等多角度的研究也已经开展，为了能够进一步完善和了解Amylin的生理活性承担机理，对于其纤维化动力学研究值得诸多学者专家的关注，也值得我们对其进行一些研究探索。对于Amylin纤维化抑制剂的研究也一直是研究热点，从多角度出发，对不同的理论模型进行分析后寻找相应的抑制剂也一直在进行，且不断有相关研究成果发表。目前的研究主要针对于各种小分子抑制剂来进行，但是小分子抑制剂来源广泛，且本身带有的毒性也不一，使许多有效的抑制剂的应用前景收到了限制，也是我们目前面的挑战之一。

1.3天然的糖尿病治疗物质

早在中国古代的中医药典籍《黄帝内经》中就有关于“消渴症”的记载^[12]，也就是我们现在说的糖尿病，那时的人们发现很多天然中草药对于“消渴症”有良好的治疗效果，像黄精，黄芪，黄芩，梨，山药，山茱萸等。如今科技发展迅猛，我们已经能够利用先进的技术来对这些天然药物进行药理分析，来验证这些植物对于糖尿病的疗效。鉴于目前先进的化学分离提取手段，我们可以将植物中的特有成分进行分离纯化，单独研究物质的药理性质。天然植物提取物大多对人体的毒副作用远小于许多人工合成药物，在应用前景上有着独特的优势。有相关研究表明，黄酮类^[13]物质和多酚类^[14]物质都对Amylin淀粉样蛋白沉积形成过程有抑制作用，通过抑制淀粉样蛋白沉积过程来对病情起到治疗效果。现有的提取和分离技术让我们从很多中草药中提取出来了其中的有效活性成分，黄芩素，黄芪甲苷，环黄芪醇和菊苣酸四种物质分别来自不同的中草药，这些中草药都曾被报道对于糖尿病患者有治疗效果，能够有效的降低血糖缓解糖尿病症状，目前很多研究都表明很多物质能够通过抑制Amylin淀粉样蛋白沉积的形成来治疗糖尿病。根据已知的研究，目前的蛋白质纤维化抑制剂主要有三种，分别是多肽类抑制剂，小分子抑制剂和抗体类抑制剂。这些抑制剂的主要是通过在蛋白质发生聚合时形成的α螺旋结构为识别位点并且进行结合来抑制蛋白质的进一步纤维化进程。已经提出了两种主要模型用于蛋白质自组装过程。一个涉及π-π相互作用，其中淀粉样蛋白形成蛋白的芳香族残基与其他残基通过π堆叠，导致淀粉样蛋白形成^[15]。该模型由几个研究支持，例如，Aβ中的热结合区域^[16]，片段16-20（KLVFF），形成类似于由全长Aβ形成的成熟原纤维，而用Ala取代的芳香族Phe20的突变体不形成淀粉样蛋白原纤维^[17]。 第二个模型涉及疏水相互作用，这也得到了多项研究的支持。 Sinha及其同事发现，Aβ中赖氨酸残基介导的疏水相互作用的破坏大大降低了Aβ肽的组装和毒性^[18]。这两种理论也成为了药物治疗的一个切入点，多酚类和黄酮类物质也因此走入了我们的视野，这些物质在植物中广泛存在，在治疗淀粉样蛋白疾病领域有着不俗的应用前景。当然除了直接抑制蛋白质纤维化的过程，目前的治疗手段还有通过基因治疗的手段降低淀粉样蛋白的表达，通过增加错误折叠蛋白的清除速率来减少淀粉样蛋白的沉积或者通过增加正确的蛋白折叠产物的稳定性来减少错误折叠蛋白的转化和产生。

1.3.1黄芩素

图1.3.1黄芩素结构式

黄芩素，又名黄芩苷元，黄芩黄素，是一种广泛存在于多种中草药中的天然物质，主要来自于黄芩以及车前草，分子式为C₁₅H₁₀O₅,在很多古代中医典籍中就有记载使用黄芩治疗“消渴症”。Paul Valender^[13]等人将黄芩素与Amylin进行共同体外培养后进行细胞实验和蛋白质体外动力学实验，并对黄芩素进行结构解析，验证了黄芩素能够有效降低Amylin的纤维化程度从而降低其细胞毒性，并且从分子层面解析了苯环上不同羟基位置的异构体的抑制效果，为我们的研究提供了依据。目前对于黄芩素治疗糖尿病机理的研究较多，比较广泛接受的是黄芩素能够消除人体内的自由基，抗脂质过氧化，抑制蛋白质以及脂肪的代谢出现紊乱，从而达到降血糖治疗糖尿病的效果。

1.3.2黄芪提取物

图1.3.2 黄芪甲苷 环黄芪醇

黄芪甲苷为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物^[19]，分子式是C₄₁H₆₈O₁₄，是中药黄芪中的主要有效活性成分之一，在有关其药理作用的记载中，有着明确的降血糖作用，能够有效提高胰岛素敏感性，在达到一定的给药量以后能够有效降低小鼠的血糖浓度。环黄芪醇属于三萜皂苷类化合物，主要由黄芪甲苷的水解得到，与黄芪甲苷作用相似。自古以来就有用黄芪治疗“消渴症”的说法，据相关统计^[20]，在治疗“消渴症”的200个古方中，约有40个古方使用了黄芪，约占20%；而在现代治疗“消渴症”的500个中医药方中，约有320个使用了黄芪，约占64%，说明中医对于黄芪对糖尿病的治疗效果从古至今一直较为认可，目前对于黄芪的糖尿病治疗效果从不同角度的机理阐述较多，说明黄芪对于糖尿病的治疗是一个复杂的综合作用的结果。对于黄芪的治疗机理的多方面探索是十分有必要的，这将有助于我们正确理解糖尿病的发病和治疗机理，从而为开发相关药物提供指导。

1.3.3菊苣酸

图1.3.3 菊苣酸

菊苣酸，分子式C₂₂H₁₈O₁₂，是菊苣和紫锥菊中提取出来的一种活性有效成分，已有相关研究表明菊苣酸对于糖尿病小鼠模型有着显著的降血糖作用^[21,22]，目前对于菊苣酸的降血糖治疗效果机理描述不一，但是可以肯定的是，菊苣酸在实际应用中表现出来了良好的糖尿病治疗效果，而且能够从多角度来改善糖尿病，说明菊苣酸对于糖尿病的治疗是一个复杂的综合作用的结果。对于菊苣酸的治疗机理的多方面探索是十分有必要的，这将有助于我们正确理解糖尿病的发病和治疗机理，从而为开发相关药物提供指导。

1.4蛋白质体外动力学监测及表征

蛋白质通过二级结构，三级结构来形成一个特定的高级结构从而具有特定的生物活性，但是这个高级结构的形成过程一直困扰着我们，也就是蛋白质折叠的动力学问题。蛋白质在体外是很不稳定的，但是普通的环境条件不会破坏蛋白质的一级结构，即蛋白质的氨基酸序列。但是温度，酸碱度这些环境因素会影响蛋白质的高级结构，从而导致蛋白质失去原有的生物活性，也就是蛋白质的变性。在上个世纪30年代，我国科学家吴宪先生便已经提出相关的概念，并得到了国际科学界的广泛认可^[23]。目前我们的研究人员已经能够用一些快速检测的方法来对蛋白质的空间构象转变进行追踪，以期获得完整的蛋白质体外动力机理的研究数据。不同蛋白质的转变速度大相径庭，这也对研究者提出了挑战，我们需要通过不断的实验来计算判断大概需要的时间从而进行完整准确的构象转变分析。蛋白质是由一定的氨基酸按照顺序联结而成的长肽链和特定的空间结构组成的生物大分子。氨基酸是含氨基和羧基的有机小分子，除了甘氨酸以外所有氨基酸都具有旋光性^[24]，为不对称结构，而蛋白还具有复杂的空间结构，因此蛋白质也有着不同的旋光性，这也为我们监测蛋白质的动力学提供了检测思路。

1.4.1圆二色谱检测

圆二色谱仪是一种通过两束圆偏振光照射样品后检测形成的椭圆偏振光来对光学活性物质进行结构检测的仪器^[25]。圆二色谱仪可以对蛋白质的二级结构，三级结构进行检测^[26]，利用判别色谱图中峰值位置可以对蛋白质中的α螺旋，β折叠等蛋白质高级结构进行检测，甚至可以对各种结构成分占比进行计算统计^[27]。我们利用圆二色谱仪对蛋白进行检测，可以了解蛋白的自组装进程，对其自组装过程的结构变化进行详细的记录。

1.4.2 ThT荧光光谱检测

ThT能够特异性的与蛋白纤维上的一些位点结合，并且随着蛋白质结构的转变改变荧光强度，在没有明显的荧光淬灭剂的存在情况下，蛋白质的纤维化过程能够大幅度增加荧光强度^[28]，可以作为蛋白质动力学的检测依据^[29]。利用酶标仪来检测荧光变化从而对蛋白质构象转变进行监测，这是目前最常用的蛋白质构象监测手段，能够有效监测蛋白质连续结构转变过程，为蛋白体外动力学研究提供研究基础。

1.4.3 原子力显微镜

原子力显微镜利用超细针尖与样品表面相作用，力学信号转变外电信号，获得样品表面微观形貌图。蛋白质在纤维化之后出现大量β折叠结构，形成大量网状结构，单层厚度约为4 nm，利用原子力显微镜的高精度纵向分辨率可以得到清晰的表面形貌图，作为光谱实验结论的辅证。

1.5研究目的

Amylin蛋白在人体中作为一种血糖调节蛋白与人类健康息息相关，Amylin蛋白的纤维化与糖尿病2型的产生密切相关。天然植物在人类历史上有着悠久的利用历史，而现在研究也表明很多天然提取物对于糖尿病有着良好的抑制和预防作用。因此我们将天然植物提取物与Amylin蛋白进行直接作用，检测两者之间是否有相互作用，以及相互作用形式与规律，探索相关天然植物提取物能否应用于未来相关药物开发。

本文打算从抑制Amylin纤维化这个角度来对二型糖尿病的治疗进行研究，通过将菊苣酸，环黄芪醇，黄芪甲苷和黄芩素四种天然植物提取物与Amylin共同作用，在酶标仪下对蛋白的荧光进行检测，获得四种天然植物提取物的抑制效果的监测结果，并针对其中的菊苣酸进行细化浓度梯度探究，辅以圆二色谱仪，原子力显微镜和动态光散射进行构象，形貌表征监测，验证菊苣酸在二型糖尿病治疗领域的应用前景和潜力，为早日攻克相关疾病积累研究基础研究数据。

第二章 四种天然植物提取物对Amylin蛋白的纤维化过程的抑制作用

2.1前言

糖尿病已经成为了目前人类的第三大健康杀手^[30]，随着全球社会发展人类生活方式的改变，患病人数逐年递增，预计到2025年将达到3亿。糖尿病是一种慢性疾病，研究表明占90%以上的糖尿病病人中都有Amylin的淀粉样沉积存在，这是诱发二型糖尿病的一个重要因素，如何消除或者抑制这些淀粉样蛋白对于治疗糖尿病有着重要的意义^[31]。