摘 要

自驱动微纳米马达是一种将其他形式的能量转化为机械能，并能实现自主运动的微纳米器件。由于具有独特的自主运动性能，微纳米马达生物传感、主动给药及微手术等生物医药领域展现出良好的应用前景。要实现微纳米马达在生物医药领域的应用就要求其具有良好的生物相容性、较强的驱动力强及较长的运动寿命长。然而，目前尚缺乏兼具以上三种特点的自驱动微纳米马达。本论文拟利用罐状结构的空间限制效应以及脲酶与尿素的特异反应，将它们在微纳米尺度进行复合，构建一种罐状结构的酶驱动马达。该马达由Au和SiO₂构成的罐状结构和脲酶组成，具有良好的生物相容性。其罐状结构有利于产物浓度的积累，形成较大的浓度梯度，从而提高微纳米马达的驱动力。具体研究内容如下：

首先，本文基于模板刻蚀法，并采用磁控溅射技术，制备得到了尺寸为2.95 mu;m，形状良好，结构完整的SiO₂/Au罐状结构。

其次，在上述结构的基础上，以半胱胺和戊二醛为连接分子将脲酶偶联在罐状结构粒子的内表面，得到了SiO₂/Au/Urease罐状微米马达。通过对酶活性的表征，得到了该微米马达上脲酶活性与尿素浓度的关系，并拟合得到其米氏常数为1.34 mM。该微米马达具有优良的自主运动性能，通过统计马达在不同尿素浓度下运动速度的统计，本文得到了罐状微米马达运动速度与尿素浓度的关系，随着尿素浓度的提高，该马达运动速度随之提高；但当其浓度达到20 mM时，马达的脲酶活性达到饱和，因此其运动速度也达到最大，为15 mu;m/s。此外，本文发现该马达在尿素浓度小于0.2 mM时，朝向开口方向运动，尿素浓度高于0.2 mM时朝着相反方向运动。通过示踪粒子的方法证明了马达在高浓度尿素溶液下有液流冲出，说明罐状微米马达在高浓度尿素条件下为微气泡驱动，在低浓度燃料下为自扩散运动。

综上所述，我们提出的SiO₂/Au/Urease罐状微米马达具有良好的生物相容性，较强的驱动力，优良的运动性能以及较长的寿命，同时本文对该微米马达在高燃料浓度下的驱动机理进行了验证，有利于推进微纳米马达在驱动机理上的研究，并促进其在生物医药领域进一步发展。

关键词： 罐状马达；脲酶；酶驱动；生物相容性；生物医药

Abstract

Self-driven micro-/nanomotor is a kind of micro-/nanodevice which can convert other forms of energy into mechanical energy and realize self-movement. Due to its unique self-movement performance, micro-/nanomotor biosensor, active drug delivery and microsurgery and other biomedical fields have shown a good application prospect. In order to realize the application of micro-/nanomotor in biomedical field, it is required that it has good biocompatibility, strong driving force and long motion life. However, there is still a lack of self-actuated micro-/nanomotor with the above three characteristics. This paper intends to use the space restriction effect of the pot-shaped structure and the specific reaction between urease and urea to compound them at the micro-/nanoscale and construct an enzyme driving motor of the canister structure. The motor is composed of Au and SiO₂ pot-shaped structure and urease, which has good biocompatibility. The pot-shaped structure is conducive to the accumulation of product concentration and the formation of a large concentration gradient, so as to improve the driving force of the micro-/nanomotor. The specific research content is as follows:

Firstly, based on the template etching method and magnetron sputtering technology, SiO₂/Au pot-shaped structures with good shape and complete structure have been prepared.

Secondly, on the basis of the above structure, urease was coupled to the inner surface of the particles using cysteamine and glutaraldehyde as the connecting molecules, and SiO₂/Au/Urease pot-shaped micromotor was obtained. The relationship between urease activity and urea concentration on the micron motor was obtained by characterizing the enzyme activity. The micromotor has excellent self-propulsion performance. By statistical analysis of the motor speed under different urea concentrations, the relationship between the motor speed and urea concentration is obtained in this paper. With the increase of urea concentration, the motor speed increases accordingly. But at the concentration of 20 mM, the urease activity of the motor reaches saturation, so the moving speed reaches the maximum, 15 mu;m/s. In addition, it was found that the motor moved in the direction of opening when urea concentration was less than 0.2 mM, and in the opposite direction when urea concentration was higher than 0.2 mM. By tracer particle method, it is proved that the motor is driven by microbubbles at high concentration of urea and self-diffusion at low concentration of fuel.

From what has been discussed above, we proposed the SiO₂/Au/Urease pot-shaped micromotor has good biocompatibility, strong driving force, good movement performance and long service life, at the same time in this paper, the micromotor drive mechanism under the condition of high concentration of fuel is verified, promote the micro-/nanomotor on the drive mechanism research, and promote its further development in the field of biomedicine.

Key Words： pot-shaped motor; urease; enzyme driven; biocompatibility; biomedicine

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2 酶驱动微纳米马达的种类 1

1.2.1过氧化氢酶驱动 2

1.2.2葡萄糖氧化酶驱动 3

1.2.3脲酶驱动 4

1.3微纳米马达的结构 5

1.3.1 双面神微纳米马达 5

1.3.2 管状微纳米马达 6

1.3.3 罐状微纳米马达 7

1.4 酶驱动微纳米马达在生物医药领域的应用 8

1.4.1 生物传感 9

1.4.2 主动给药 10

1.5本论文的立题思想及其主要研究内容 11

SiO₂/Au/Urease罐状酶驱动微米马达的制备及其运动性能的研究 13

2.1引言 13

2.2实验部分 15

2.2.1实验试剂与仪器设备 15

2.2.2溶液的配制 16

2.2.3 SiO₂/Au罐状微米结构的制备 16

2.2.3 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达的制备 16

2.2.4 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达的表征 17

2.3实验结果与讨论 19

2.3.1 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达结构的表征 19

2.3.2 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达成分的表征 19

2.3.3 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达酶位置的表征 20

2.3.4 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达酶含量的表征 21

2.3.5 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达酶活性的表征 21

2.3.6 SiO₂/Au/Urease罐状微米马达速度的表征 23

2.3.7 SiO₂/Au/urease罐状微米马达驱动机理的验证 24

2.4本章小结 24

第三章 结论与展望 26

参考文献 27

致谢 32

本科毕业设计期间的学术成果 33

第一章 绪论

1.1引言

1959年，美国著名物理学家Feynma¹在名为“Therersquo;s Plenty of Room at the Bottom”的演讲中对微纳米级别小分子机器的出现和发展进行了展望，他认为未来人工合成的小分子机器可以像大型机器一样完成特定任务。微纳米马达是一种可以将其他能量转化为自身动能的小型装置，并且能够在液体中实现自我推进的同时执行复杂的任务²。在过去的几十年中，微纳米马达活跃在很多方面，例如环境治理^3minus;4、生物传感^5minus;6、主动给药^7minus;8、微创手术^9minus;10等等，尤其是在生物医药领域（生物传感和主动给药）有巨大的应用前景。而要实现微纳米马达在生物医药领域的应用就需要其具有较强的驱动力，较小的尺寸，易于表面功能化，生物相容性好等。自驱动马达从燃料上可分为以H₂O₂¹¹，水/酸¹²以及生物分子¹³等驱动的微纳米马达。从驱动机理来说，又分为自扩散泳¹⁴，自电泳¹⁵，热泳¹⁶以及气泡推动^17minus;18的微纳米马达。从马达的形状来说可分为管状^19minus;20，棒状²¹，球状^22minus;23，双面神^24minus;25和罐状^26minus;27等。

自驱动微纳米由于其独特的自主运动的性能受到大多数研究者的关注，目前研究的微纳米马达大多以H₂O₂作为燃料，通过分解H₂O₂产生氧气浓度梯度或气泡驱动微纳米马达²⁸，一般而言此方法需要较高的H₂O₂浓度，而高浓度的H₂O₂具有强氧化性，对生物体有害，因此不利于生物医药方面的应用。水/酸作为一种无毒的燃料也受到众多研究者的青睐，例如通过镁水反应产生氢气为微纳米马达提供动力²⁹，但随着时间的推移，反应物镁会逐渐消耗殆尽，此时马达就会停止运动，因此其使用寿命是一个很大的问题。为了得到一种生物相容性好，使用寿命长的微纳米马达，研究者们提出了酶驱动马达。

现如今，多种多样的酶驱动马达已经被广泛研究和关注。本章对酶驱动马达的种类，微纳米马达的形状以及酶驱动马达在生物医学领域的应用进行了全面清晰的论述，并在此基础上提出本文的立题思想。

1.2 酶驱动微纳米马达的种类

在自然界的启发下，以催化反应为动力的人造微纳米马达得到了发展。由于酶催化具有生物相容性、通用性并且生物体内存在其燃料等独特的优点³⁰，成为替代常用有毒燃料的一种有效的方法。在这方面，过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶和脲酶已经被证明可以在相应底物的生理浓度下驱动微纳米马达。本小节将详细介绍总结这三种微纳米马达。

1.2.1过氧化氢酶驱动

过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，可以催化分解H₂O₂产生水和氧气，由于过氧化氢酶快速的催化作用和氧气分子较低的溶解度，过氧化氢酶驱动的微纳米马达一般以气泡驱动的方式推动微纳米马达。因此该微纳米马达具有较强的驱动力，可在高离子强度的溶液中实现自主运动³¹。但是有些微纳米马达表面结构不利于气体分子的聚集，无法形成气泡，反应产物在微纳米马达的一侧聚集，使粒子两侧形成浓度梯度差；产物的扩散引起粒子周围的流体流动，推动马达运动，这种由物质扩散引起的粒子运动称为自扩散驱动²⁶。迄今为止，各种各样的过氧化氢酶驱动的微纳米马达已被研究出来。

例如Ma等人³²报道的尺寸为94 nm的介孔SiO₂纳米马达。如图1.1A所示，过氧化氢酶被固定到双面神介孔SiO₂纳米马达的表面用于催化H₂O₂，制备了过氧化氢酶驱动的纳米马达。但该马达仅仅表现为增强扩散，没有实现其自主运动，该马达的扩散系数D从1.50 mm²/s 提高到3.75 mm²/s，大约增加了150%。为了实现过氧化氢酶驱动微纳米马达的自主运动，并得到运动速度较快的微纳米马达，研究者将目光转到气泡驱动的微纳米马达。例如Ma等人³³报道的双面神介孔二氧化硅簇。如图1.1B所示，利用制备介孔二氧化硅时易团聚的现象，制备了介孔二氧化硅簇，然后将过氧化氢酶固定到介孔二氧化硅簇上，因为其粗糙表面，有利于气泡成核生长，通过产生气泡实现了过氧化氢酶驱动微纳米马达的自主运动。并且在较低的H₂O₂浓度（1 wt%）下也可以实现快速运动。除此之外，管状马达由于其空心结构有利于产物的积累，因此受到了研究者的广泛关注。Sanchez等人³⁴报道的过氧化氢酶驱动的管状微米马达。如图1.1C所示，在管状马达的内壁固定过氧化氢酶。该马达实现了低H₂O₂浓度下的快速运动，据报道，该马达在1.5 wt%的H₂O₂下，马达的运动速度为226.1 plusmn; 21.1 micro;m/s。同样Wang等人³⁵报道的过氧化氢酶驱动的锥形管状微米马达。如图1.1D所示，该管状微纳米马达的内壁偶联过氧化氢酶。此方法得到了可以连续产生气泡的微纳米马达，并且由于其锥状结构，使得气体分子更容易聚集并且气泡只从大口一侧出来，因此其运动速度在1 wt%的H₂O₂下可以达到380 micro;m/s。

过氧化氢酶催化分解H₂O₂的速度很快，有利于实现马达的快速运动，但是高浓度H₂O₂的强氧化性会对生物组织造成损伤，其生物不相容性限制了其在生物医药领域的应用。

图1.1过氧化氢酶驱动的微纳米马达典型实例（A）介孔SiO₂纳米马达³²；（B）双面神介孔二氧化硅簇³³；（C）Ti/Au管状微米马达³⁴；（D）聚乙烯二氧噻吩（PEDOT）/Au锥形管状微米马达³⁵

1.2.2葡萄糖氧化酶驱动

葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内。人体血液中葡萄糖的正常含量为3.61minus;6.11 mM，该物质可在葡萄糖氧化酶的作用下反应生成葡萄糖酸和H₂O₂，为了得到生物相容性好的产物，一般而言可以通过Pt等无机催化剂或者过氧化氢酶进行后续反应，最终得到产物水和氧气。葡萄糖氧化酶驱动的微纳米马达具有良好的生物相容性，因此该马达也受到研究者的广泛关注。

例如，Schattling等人³⁶制备了葡萄糖氧化酶和Pt两步催化的双面神马达。如图1.2A所示，该马达利用多聚赖氨酸 (PLL) 形成双面神结构，另外一个半球则是固定上Pt和葡萄糖氧化酶（GOx）。当该马达处于葡萄糖溶液中时，就会产生串联反应，从而得到产物水和氧气。该直径为2.7 micro;m的马达在400 mM的葡萄糖溶液中的有效扩散系数D_eff约为0.4 micro;m²/s。可见其运动速度很慢，其原因有可能是葡萄糖氧化酶和Pt的催化速率都较低，因此其产物产生速率慢，无法形成较高的浓度梯度，为了改进这一方法，Schattling等人³⁷发表的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶两步反应催化葡萄糖的SiO₂/PDA (多巴胺) 双面神马达，如图1.2B用多聚赖氨酸耦合聚乙二醇 (PLLminus;gminus;PEG) 打破粒子的对称结构，在马达表面非对称地固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。该直径为800 nm的马达在200 mM的葡萄糖溶液中扩散速度达到最大，其扩散系数D为0.373 micro;m²/s。由于双面神马达的结构不利于产物的聚集，因此其他易于产生浓度梯度的结构受到众多研究者的关注。例如Abdelmohsen³⁸等人发表的口形囊泡结构的酶驱动马达。如图1.2C，其口形结构可以将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶包裹，通过调节四氢呋喃/二氧己环 (4:1 v/v) 的浓度可以改变马达的开口大小，从而调节粒子的运动速度，并保护囊泡内的物质少受液体的干扰。马达的平均大小为500 nm，该马达可以在较低的葡萄糖溶液 (5 mM) 中实现自主运动，并在10 mM的浓度下有一个较快的速度11 micro;m/s。除了罐状外，管状也因为空间狭小而易于产物的聚集而受到青睐，例如Pantarotto等人³⁹发表的长度为1 micro;m，双酶驱动的碳纳米管 (图1.2D) 。由于管状马达狭小的空间，该纳米管是通过双酶两步催化分解葡萄糖产生氧气推动的，因此该马达实现了较快的运动。在100 mM的葡萄糖溶液中，该马达的运动速度达到0.2minus;0.8 cm/s。虽然该碳纳米管由于气泡的产生而实现了较大的运动速度，但是碳纳米管的毒性将成为其应用的一个大问题。

葡萄糖氧化酶驱动的马达可通过两步反应得到水和氧气，其反应物和生成物皆具有良好的生物相容性。两步反应中反应速度主要取决于反应速度慢的一个，而葡萄糖氧化酶分解葡萄糖的反应速度比较慢，无法形成较高的浓度梯度，因此一般而言葡萄糖氧化酶驱动的马达为自扩散泳，所以葡萄糖氧化酶驱动的微纳米马达的运动速度一般来说不是很高。

图1.2 葡萄糖氧化酶驱动的微纳米马达的典型实例（A）葡萄糖氧化酶/Pt驱动的双面神微纳米马达³⁶；（B）葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶驱动的双面神微纳米马达³⁷；（C）葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶驱动的囊泡型微纳米马达³⁸；（D）葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶驱动的碳纳米管³⁹

1.2.3脲酶驱动

脲酶广泛分布于植物的种子中，也存在于动物血液和尿液中。尿素也在生物体内广泛存在，一个人体内正常的尿素浓度为2.5minus;6.4 mM。脲酶催化分解尿素生成氨气和二氧化碳，其反应物和反应产物都对生物体无害，其产物还可以在生物体内继续转化为铵盐和碳酸盐。同时脲酶的反应速度较快，二氧化碳的溶解度也较低，因此有可能实现气泡驱动，脲酶驱动的微纳米马达的发现可以说为生物医药方面的应用开辟了一个新的道路。

例如Hortelatilde;o等人⁴⁰发表的脲酶驱动的介孔SiO₂微纳米马达（图1.3A），将该马达置于尿素溶液中时，可以增强微纳米马达的扩散系数。该马达（尺寸约为344 nm）在100 mM尿素溶液中的扩散系数D约为1.2 micro;m²/s。为了进一步提高脲酶驱动马达的速度，由于双面神结构天然的不对称性，可以只在一侧发生反应，从而形成一定的浓度梯度，因此研究者利用此结构进一步增强马达的扩散系数。如Ma等人²⁴发表的脲酶驱动的空心介孔SiO₂双面神马达。如图1.2B所示，双面神马达一侧偶联脲酶，在尿素溶液中进行反应，导致该马达脲酶一侧的产物分子聚集，从而产生较大的浓度差，推动粒子运动，该直径为389 nm的马达在25 mM尿素溶液中的扩散系数D为1.3 micro;m²/s。 但通过此方法只能增强扩散，由于管状马达的狭小空间利于产生较高的过饱和度，利于气泡的产生，因此管状脲酶驱动的马达也被广泛研究。如图1.3C所示，Ma等人⁴¹发表的脲酶驱动的SiO₂管状微纳米马达，该马达的内壁和外壁都偶联有脲酶，在尿素溶液中，该马达内外产生较大的浓度梯度，推动马达向前运动。由于其推动力较大，该10 micro;m长的马达在100 mM的尿素溶液中的运动速度约为6.5 micro;m/s。随着马达长度的减小，其速度会增加，5 micro;m长的马达在相同尿素浓度下，运动速度可以达到9.2 micro;m/s。

脲酶驱动的微纳米马达具有良好的生物相容性，且其催化速率较快，受到了研究者的广泛关注，也为其在生物医药方面的应用打下良好的基础。但目前为止脲酶驱动的马达无法在高离子强度下的溶液中进行运动。

图1.3 脲酶驱动的微纳米马达的运动实例（A）介孔SiO₂微纳米马达⁴⁰（B）空心介孔SiO₂双面神马达²⁴（C）SiO₂管状微纳米马达⁴¹

1.3微纳米马达的结构

目前，各种各样结构的微纳米马达已经制备出来了，如管状，丝状，棒状，球状，双面神，罐状结构等⁴²，不同的形状结构有不同的驱动机理³¹。本节将系统的描述双面神结构，管状结构以及罐状结构微纳米马达的研究现状。

1.3.1 双面神微纳米马达

在Casagrande等人⁴³1988年的开创性研究中，首次使用了Janus微珠这个词来描述一个半球亲水另一个半球疏水的球形玻璃颗粒。Janus粒子是以古罗马神Janus的名字命名的，通常包括两面，一面为活泼层，另一面为惰性层，双面神结构马达的不对称性使其易于形成浓度梯度，从而驱动微纳米马达。同时这种马达的制备过程简单，并易制备出尺寸微小的马达。现如今，双面神微纳米马达已应用于许多领域⁴⁴。

微纳米马达的制备过程较为简单，一般通过磁控溅射或者偶联惰性材料的方法形成不对称结构。迄今为止制备的双面神微纳米马达的驱动方式可以分为自扩散泳，自电泳和气泡驱动。由于溶质与胶体表面相互作用的结果，悬浮在溶液中的粒子形成溶质的浓度梯度驱动，其机制称为扩散泳⁴⁵。如图1.5A所示，Ebbens等人¹⁴制备的PSPt双面神微纳米马达H₂O₂溶液中表现出的运动方式为自扩散泳，沉积在微纳米马达表面的Pt分解H₂O₂产生溶质，并形成梯度，使得微纳米马达以自扩散泳的形式运动。Brown等人¹⁵提出他们制备的AuPt 双面神微纳米马达的推进机制为自电泳，其中Pt表面离子定向流动产生局部电场，使得马达表面形成质子的浓度梯度，驱动粒子运动（图1.5B）。同时气泡也可以驱动双面神马达，如Gibbs等人⁴⁶制备的Mn的配合物、Ag基和MnO₂基的双面神微纳米马达，可以在H₂O₂存在的情况下推动双面神马达，并在其中可观察到气泡，说明该马达为气泡驱动，该马达在7%的H₂O₂中运动速度达到6 mu;m/s（图1.5C）。

双面神微纳米马达的驱动机理与很多因素有关，例如表面的粗糙程度，粒子的大小等³¹。总的来说双面神马达具有不对称结构，所采用的制备原料的生物相容性更好等优势，因此双面神马达在生物医药应用领域有很大的前景。但其表面为凸面，不利于产物的聚集，而无法形成较高的浓度梯度，因此一般而言双面神马达的驱动力较弱。

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