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多空电导聚吡咯-聚乙烯醇复合材料及其作为生物材料的应用

通过使用聚（乙烯醇）（PVA）批量修改聚吡咯（PPy），在存在PVA的反应液中发生吡咯电聚合反应，四乙胺高氯酸盐（TEAP）作为电解质。PPY-TEAP-PVA膜合成的表面形貌使用扫描电子显微镜进行了研究，然后这膜的更深层特征使用X射线光电子能谱，测出电导率，水接触角，和表面积测量。 PPY-TEAP-PVA复合材料具有导电性，亲水性和微孔，高比表面积。它具有作为生物材料在血液相容性方面的潜力以及作为生物传感和细胞培养基的功能。聚乙烯醇在膜中的存在减轻血液蛋白吸附，并且多孔性PPY-TEAP-PVA膜导致固定在一个无孔聚吡咯薄膜上的共价葡萄糖氧化酶的数量增加了10倍。与组织培养聚苯乙烯相比PC12细胞在PPY-TEAP-PVA膜上的粘附和生长也显示被加强。在48小时候后在单层膜的表面细胞粘附增殖形成。

引言

导电聚合物，具有迅速和不同氧化态之间的可逆转换能力，能在生物材料中扮演一个至关重要的角色。另外，在电聚合作用过程中，各种各样的生物材料能与这些聚合物合并在一起。因此，导电聚合物在通过作为支架，生物传感器，控制释放功能等矩阵的矩阵控制和监测生物反应有巨大潜力。在生物应用的导电聚合物中聚吡咯（PPY）是被研究最为彻底的，因为其高导电性，灵活的制备方法，表面改性，优环境稳定性，离子交换能力4和体外生物相容性5。Langer等人已经证明通过聚吡咯薄膜用于细胞培养的电流通路导致细胞轴突生长的增加6。Wong等人报告称当聚吡咯处于中性状态时细胞的正常扩散以及在纤维连接蛋白包覆聚吡咯上合成DNA两者都会被抑制。另外，PPY和其衍生产品已经引起了人们对生物传感器发展的极大兴趣，因为以下几点原因：聚吡咯的最佳氧化还原电位，从水电解质溶液中生长出PPY的可能性，以及它由于固有的尺寸排阻特性而具有的高专一性。

限制了电化学合成聚吡咯膜的发展的本质原因是它有限的表面面积。包括多孔介质内的聚合物，多孔水凝胶内的电化学聚合，和离子交换的合成聚合物在内聚合物通过化学聚合合成使得这一限制在一定程度上被克服。我们目前的工作是，通过使用高氯酸四乙基铵电化学合成膜（TEAP）作为电解质制备微孔聚吡咯聚（乙烯醇）（PVA）。四乙铵高氯酸盐在电化学合成PPY上的使用已经证明可以制作多孔膜，而且将PVA参入到该膜能够预期到蛋白质在基底上的吸附发生强烈衰减从而提高它的生物相容性。所制备的具有大表面积，良好透气性和亲水性的多空PPY-TEAP-PVA 膜对于酶固定化会是一个理想的基底，正如在本工作中所示的葡萄糖氧化酶作为模型酶。酶是通过与膜接枝共聚的丙烯酸基团共价连接到聚合物薄膜上的。PPY-TEAP-PVA膜在血液蛋白吸附方面上的血液兼容性也得到测定并且也与传统合成聚吡咯膜“无孔”进行了比较。最后，对作为用于研究大鼠PC12细胞的吸附和生长的的基底的3维结构的膜进行了研究。

试验阶段

材料.吡咯（99%），从奥德里奇化学有限公司获得，使用前蒸馏，并储存在10℃下，氮气环境下。聚乙烯醇（PVA，Mw=12500，水解度87%）从BDH公司购买（英国)。从奥德里奇化学有限公司获得的丙烯酸单体（AAC）在使用前需要蒸馏。水溶性1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（WSC）是从Dojindo化工有限公司购买（日本）并且可以用于常规用途。从牛血浆中提取的纤维蛋白原（BFG），葡萄糖氧化酶（GOD，II型的黑曲霉，15 500台g-1），过氧化物酶（I型，山葵，290 000单位G-1），acirc;-D( )-葡萄糖和邻联茴香胺是由Sigma公司BioRad公司提供。一种用于蛋白质分析的Bio-Rad染料（目录号500-0006）从Bio-Rad化工有限公司获得。10times; PBS从皮尔斯化学有限公司获得。I型胶原（vitrogen 3.0毫克/毫升，在0.012nhcl）从凝聚科技股份有限公司购买。胰蛋白酶EDTA溶液，青霉素，链霉素，神经生长因子（NGF），培养基，L-谷氨酰胺，和热灭活的马血清全部都是从西格玛化学公司购买。牛血清是从胚牛血清中获得。溶剂及其他试剂均为分析级，无需进一步纯

PPY-TEAP-PVA膜的电化学合成。吡咯的电化学聚合使用 Autolab-PGSTA30（万通施密特有限公司）在标准的三电极电池进行操作。一个铂丝作为反电极（阴极），和一个Ag/AgCl电极用作参考电极，采用不同形状的高抛光不锈钢作为工作电极（阳极）。反应溶液制备如下：首先制备了聚乙烯醇溶液，加入5克聚乙烯醇至100毫升的双蒸馏水。该溶液在80°C下搅拌3小时，得到一个均匀的溶液，然后储存在室温下。上述溶液（15毫升）搅拌30 min用干燥氮洗涤以去除溶解氧。含2克TEAP的乙腈（5毫升）缓缓加入，并将混合物搅拌至均匀溶液。吡咯（0.5毫升）然后加入，和最终的混合物搅拌和脱气的另一个10分钟。在室温和干燥的氮气氛下，在上述溶液中使用0.3、1.7V之间的电位进行100次扫描可以在工作电极上电沉积PPY。这个获得的PPY-TEAP-PVA膜然后从电极上取出并用清水冲洗24小时。最后，这薄膜在真空下干燥，然后储存在干燥箱。使用相同的条件合成PPY-TEAP膜相比PPY-TEAP-PVA膜，反应混合物中没有PVA.

薄膜的表面特征。在轴HSI光谱仪（Kratos Analytical公司）上，使用单色铝氪X射线源（1486.6 eV光子）在一个恒定的停留时间为100毫秒和40电子伏特的能量，对膜表面进行了XPS分析。阳极电压为15千伏，和阳极电流为10毫安。在分析室的压力保持在7times;10-6pa或在更低的压强下测量。聚合物薄膜被安装在标准样品螺柱双面胶带。在90角的光电子起飞角（相对于样品表面）最核心的型号被采集到。为了弥补表面充电效应，所有核心级光谱相对于C 1s烃的峰值为284.6 eV。在谱反褶积中，高斯峰的线宽（半峰全宽）为一个特定光谱中的所有组分。在考虑到决定实验的敏感因素的情况下进行修正，由XPS峰面积比，表面元素组成可以确定。

采用四探针法（signatone公司）测量并用由van der Pauw法导出的公式计算了聚吡咯薄膜的电导率。在JEOL JSM 5600lv扫描电子显微镜上获得了扫描电子显微镜（扫描电子显微镜）图像。样品用惰性气体清洗并且用一层薄薄的铂薄膜作影像进行溅射镀膜。使用一台有氮气的Quantachrome NOVA3000作为吸附质测定比表面积。

蛋白质吸附。蛋白吸附的程度是利用高炉煤气作为模型蛋白检测的因为这种蛋白质的吸附众所周知与血液成分与基底表面的相互作用密切相关。BFG溶解在柠檬酸-磷酸缓冲盐溶液（CPBS）（0.01msodium 0.01msodium柠檬酸，磷酸，0.12msodium氯，pH 7.4）25浓度为1毫克/毫升。聚吡咯薄膜首先在缓冲溶液中平衡放置2小时。缓冲液用约6mL的蛋白质溶液代替，将其在37°C也测试表面接触2小时。经过这一周期，薄膜从蛋白质溶液中取出，然后轻轻地用CPBS水清洗两次，用蒸馏水清洗两次。用BioRad蛋白染色试剂和改进的染料相互作用方法膜蛋白吸附量就可以被确定。实验至少要进行3次，并计算平均值。

葡萄糖氧化酶固定在PPY-TEAP-PVA膜。a.接枝AAC。 PPY-TEAP-PVA薄膜被切成约2times;3㎝2的条带，并在配有圆柱形石英反应器室的Anatech SP100等离子系统中受到氩等离子体辉光放电10秒。辉光放电是在等离子体功率为35 W，应用频率为40 kHz振荡器，以及约80 Pa的氩气压力下发生的。等离子体处理的膜然后在空气中暴露10分钟以便影响用于后续的接枝共聚的表面的过氧化物和过氧化氢的形成。浓度范围在0.5到6vol%之间的AAC溶液在高硼硅管中制备并用干氮脱气处理约30分钟。等离子体预处理的聚吡咯膜浸润溶液中，将其在脱气处理5分钟。管被紧塞并用硅橡胶密封，然后在28℃下在瑞科回转光化学反应器（Riko化学产业有限公司，rh400-10w）暴露于紫外线的照射35分钟。表面接枝膜然后用大量蒸馏水漂洗并浸泡在水浴中，连续搅拌24小时以去除残余单体的均聚物。这些样品被用作 PPY-TEAP-PVA-AAc在随后的讨论。

b.表面改性的聚吡咯膜的葡萄糖氧化酶固定化。目前的工作中使用的葡萄糖氧化酶的固定化的方法类似于固定的其他酶，如胰蛋白酶，在常规的聚合物基材上的方法。对于葡萄糖氧化酶共价固定到 PPY-TEAP-PVA-AAc膜上，COOH基团接枝的AAc聚合物在4°与WSC C 0.1 M PBS中含有5毫克/毫升WSC下预活化一个小时。聚合物薄膜然后被转移到 0.1 M PBS( ) (pH 7.4,0.02 M CaCl2）含有4毫克/毫升的葡萄糖氧化酶。固定化被设定在在4°C下进行10小时的温和搅拌和在相同温度下，不搅拌10小时。在那之后，在大量的PBS（ ）25℃处理1小时，可逆结合葡萄糖氧化酶发生解吸。固定在PPY薄膜上的葡萄糖氧化酶的数量通过改进的染料相互作用，使用Bio-Rad蛋白染色试剂方法来确定。用双蒸馏水将染料溶液稀释五倍。已知浓度的GOD溶液（0.1ml）被加到5ml的染料溶液中去。葡萄糖氧化酶染料溶液保存3小时并在5000转下离心15分钟。在后续的加工中，葡萄糖氧化酶染料配合物沉淀，并且自由染料保持在上一层。吸光度在465nm的清液（使用岛津UV-3101PC扫描分光光度计测定）被用于标准校准。对固定化酶的定量测定，染料溶液（5毫升）加入到试管中，固定化酶的PPY薄膜浸渍在染料溶液中。反应3小时后，除去膜，并测定染料溶液的吸光度在465纳米。固定在PPY薄膜表面上的葡萄糖氧化酶的数量从标准校准中计算出来。

C.酶法检测。自由和固定化神的酶活性使用在西格玛技术公告的方法（基于连续分光光度法测定的量的过氧化氢形成的酶的自由和固定化的上帝的酶的活性测定）。测定混合物包含过氧化物酶溶液0.1ml（60单位/毫升），2.4mlof染料缓冲溶液（0.05 M醋酸缓冲液，0.21毫米的邻联茴香胺溶液，0.5mlofacirc;pH5.1）和D（ ）-葡萄糖溶液（10重量%），被移进试管。在混合液中的反应是由加入0.1毫升自由葡萄糖氧化酶溶液或浸渍固定的葡萄糖氧化酶PPY膜开始的，当在500nm时的吸光度被检测是恒定的。在500nm处，记录到吸光度增加，并且最大线性率被用来评估自由和共价键葡萄糖氧化酶的活性。

细胞培养与细胞粘附实验。从大鼠PC12细胞ATCC（美国典型培养物保藏）传代培养至少一次解冻后，在小腿皮肤胶原组织培养瓶培养（Falcon）用含10%马血清的热灭活，5%胎牛血清、100 U/ml青霉素链霉素和0.3 g / L谷氨酰胺。细胞保持在37°C与加湿5% CO2气氛的孵化器。介质每天都被更换，而且细胞传代后脱离与胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-EDTA）。

圆盘形ppy-teap-pva薄膜被放置在24孔细胞培养板。然后将板用70%乙醇消毒3 h，PBS洗涤三次。细胞在室温进行培养之前有些基板涂覆有0.01%的胶原蛋白溶液在PBS中处理一晚上。四种类型的表面上附着的细胞测定：胶原蛋白覆膜和聚吡咯TEAP PVAfilms和胶原覆膜和原始组织培养聚苯乙烯（TCPS）。

细胞从组织培养瓶中分离，用离心法收集细胞，并用通过实验测得的含10%马血清、5%胎牛血清、100 U/ml青霉素链霉素在2.5*10^5细胞/ml的混合液进行热灭活。含中上述细胞（200iacute;L）被分配在24孔细胞培养板中含有不同的膜以产生所需要的细胞密度为5*10^4的细胞孔。然后将板放在一个湿CO2气氛孵化器5%。上述实验也在相同NGF添加量浓度为50纳克/毫升的上述培养基中进行操作。这种浓度已被证明是诱导最大的轴突生长。

细胞贴壁法，2小时后取出钢板，轻轻摇动。在每个细胞中含有独立的吸气，以及立即用PBS洗三次。3%体积戊二醛水溶液加入，和样品保存在4°C 5小时。戊二醛溶液除去，和样品，用PBS冲洗，然后用25，50，70，95、100%乙醇分别脱水10分钟。样品，然后干燥，并溅射镀膜的铂薄膜的扫描电镜表征。

图一.XPS C 1s和N 1s的核心级光谱（A和B） PPY-TEAP膜（C和D）和 PPY-TEAP-PVA膜。

结果与讨论

PPY-TEAP-PVA膜的表征。对PPY-TEAP膜表面成分和PPY-TEAP-PVA薄膜的XPS测定的比较如图1所示。因为该表面被用于在前面的部分中所描述的实验所以我们可以得到这样的结果，在电聚合反应过程中膜表面面向电极。在286.2 eV的峰组分的存在（C-OH），287.6 eV（CDO），和288.7eV（COOH）在C 1s的核心级光谱的ppy-teap（图1A）表明一些表面氧化或电荷转移络合氧。然后1核心级光谱的ppy-teap膜（图1 B）显示，由于在399.4 eV的NH物种主要的峰高结合能的尾巴400 eV以上归因于带正电荷的氮。在397.7 eV的小峰组成（钕）可能是某种程度的过氧化效果的膜或去质子化的电化学聚合过程中的膜清洗过程中聚合后。N /N的比例约为0.29，这与先前的研究报道聚吡咯掺杂水平一致。在约207 eV的Cl 2p的核心级信号的存在（由于ClO4-阴离子）在宽扫描电影谱进一步证实了薄膜的掺杂状态。对于 PPY-TEAP-PVA膜，C 1s的核心级光谱（图1C）显示的那些相同的峰值PPY-TEAP膜组

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