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非水解溶胶 - 凝胶法简便地制备表面键合的氧化锆有机 - 无机杂化涂层，用于样品制备。 儿茶酚胺神经递质的毛细管微萃取。

作者：Abdullah Al Handal, Stephanie Mengis, Jacob Matthews, Abdul Malik，南佛罗里达大学化学系，4202 E. Fowler Avenue，CHE 205，Tampa，FL 33620-5250，USA

摘要：非水解溶胶 - 凝胶（NHSG）路线用于创建新型氧化锆 - 聚丙烯氧化物（ZrO2-PPO）溶胶 - 凝胶混合吸附剂，以表面涂层的形式提取和预浓缩儿茶酚胺神经递质和与其脱氨基结构相关的分子代谢物。与其他由无机过渡金属氧化物制成的吸附剂相比，所提出的杂化有机无机吸附剂促进了可逆吸附性质，允许通过LC-MS兼容的流动相有效解吸提取的分析物。提出的溶胶 - 凝胶杂化吸附剂通过提供优异的pH稳定性（pH范围：0-14）和各种分子间相互作用，有效克服了传统二氧化硅或聚合物基吸附剂的主要缺点。采用ZrCl4对PPO的非水溶胶 - 凝胶处理用于PPO上末端羟基的衍生化，提供了以增强的溶胶 - 凝胶反应性为特征的含三氯化锆的端基。 NHSG ZrO2-PPO吸附剂对儿茶酚胺具有优异的微萃取性能，检出限低（5.6-9.6 pM），高运行重现性（RSD 0.6-5.1％），高解吸效率（95.0-99.5％）和高富集因子 （〜1480-2650）分别从合成尿样中提取多巴胺和肾上腺素。所提供的溶胶 - 凝胶吸附剂为常规提取介质提供了有效的替代方法，提供独特的理化特性和优异的萃取能力。

关键词：非水解溶胶 - 凝胶法 毛细管微萃取（CME） 表面氧化锆 - 聚丙烯 氧化物吸附剂涂料 pH稳定性 儿茶酚胺 解吸效率（DE）

1.概述

从生物基质（如尿液）中有效提取，预浓缩和检测儿茶酚胺（多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素）的分析工具从临床角度来看是非常重要的。已经研究了儿茶酚胺及其代谢物作为诊断和监测与不同类型癌症和神经障碍有关的肿瘤的潜在生物标志物[1]。这些肿瘤产生的儿茶酚胺过多会导致“高胆固醇血症”，可能引起脑血管意外，心力衰竭，心肌病等心血管系统等健康并发症[2]。儿茶酚胺主要以下列形式排出尿液：不变，脱氨基代谢物和邻甲基化胺（甲肾上腺素）。分析尿液，血浆或血液样本中的儿茶酚胺需要样品制备，预浓缩和清除步骤，以最小化生物基质中可能存在的任何干扰成分。 在目前的实践中，儿茶酚胺样品预处理主要通过使用两种吸附剂的固相萃取（SPE）进行：（a）聚合反相树脂和（b）苯基硼酸官能化二氧化硅颗粒。聚合物吸附剂通常由N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯单体制成[3]，它们具有优异的pH稳定性以及平衡的亲水疏水特性，但对极性儿茶酚胺具有低特异性亲和力，可以通过化学修饰（衍生化）儿茶酚胺提取前。这通常通过形成二苯基硼酸盐 - 儿茶酚胺复合物[4]来实现，以促进其通过HPLC [5]或毛细管电泳[6]的分析。 一个显着的缺点是由有机聚合物制备的提取床具有类似于由聚合物材料制备的色谱固定相的缓慢的传质特性[7]。这可能导致提取的分析物从吸附剂床延迟或不完全解吸，导致样品损失和/或携带问题。

具有苯基硼酸（PBA）配体的二氧化硅颗粒也已广泛用于固相萃取（SPE），用于清除和富集儿茶酚胺样品。 PBA配体对儿茶酚胺中存在的顺式二醇基团具有高亲和力[8]。 络合配体（苯基硼酸盐，pKa〜9.5 [9]）的活化需要用高pH缓冲液（pH10-12）[10]调节SPE柱，导致由于pH不足导致的PBA-SPE柱的主要缺点 已知具有窄操作pH窗口（pH 2-8）的二氧化硅基颗粒的稳定性[11-14]。氧化铝已被用于提取以SPE吸附剂形式提供pH稳定的吸附剂的儿茶酚胺[15-21]。 氧化铝的极强吸附特性需要pH操作，并使用磷酸盐缓冲液解吸和洗脱提取的儿茶酚胺。

使用不同的金属/准金属醇盐前体，Malik及其同事[22-25]开发了许多溶胶 - 凝胶CME萃取相，在CME-HPLC中提供优异的pH稳定性（0.0-14.0），以及在CME-GC中增强的热稳定性操作。 它们包括二氧化钛 - [22,26]，氧化锆 - [23]和基于锗的[14,24,25]杂化有机 - 无机CME涂层。 溶胶 - 凝胶涂层路线为合成有机 - 无机杂化材料提供了一种简单，方便和有效的方法[27]。 溶胶 - 凝胶涂层成功的关键（除了所创造的混合材料的独特物理和化学性质）是溶胶 - 凝胶涂层与基底（例如熔融石英纤维或毛细管）的化学键合。

软管微萃取介质。非水解（非水性）溶胶凝胶（NHSG）路线已经在催化领域广泛研究以产生金属/准金属氧化物[28,29]。在非水环境中，过渡金属卤化物（例如ZrCl 4）同时经历醇解和缩合反应，导致形成过渡金属氧化物。 [30] NHSG生成的过渡金属氧化物具有比布朗斯台德酸碱基位点更好的耐水性，增强的均匀性和更多的路易斯酸位点[28,29,31,32]。 NHSG路线可以在有机溶剂中提供均匀分散的过渡金属氧化物颗粒，并允许用有机部分进行简单的表面改性[33-35]。后来的性质对于使用非水溶胶 - 凝胶途径来产生具有共价键合的有机配体的杂化有机 - 无机材料是重要的。在这里，我们介绍了一种新型氧化锆基溶胶 - 凝胶杂化有机无机吸附剂的合成和分析评估的系统研究，以提供集成两亲性质的生物相容性萃取介质，具有增强的热，机械和pH稳定性特征，这对于分析含水样品中的儿茶酚胺和与其脱氨基代谢物结构相关的分子。

1. 实验部分

2.1.材料和仪器

氯化锆（IV），氯化锆（IV），乙醇，1-丁醇，甲苯，羟基封端的聚环氧丙烷（Mavg 3500），冰醋酸，儿茶酚，喹啉，间苯二酚，4-羟基苯甲酸，苯甲酸，香草醛，对乙酰氨基酚，盐酸多巴胺，盐酸肾上腺素和盐酸羟色胺购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）。 HPLC级溶剂（甲醇二氯甲烷，四氢呋喃），聚丙烯微量离心管和微量移液管吸头购自Fischer Scientific（Waltham，MA）。具有聚酰亚胺外部保护涂层的熔融二氧化硅毛细管（250m i.d.）购自Polymicro Technologies（Phoenix，AZ）。在本研究中使用以下色谱设备：（a）配备有二极管阵列检测器（Agilent Inc.，Santa Clara，CA）的安捷伦1100系列HPLC系统，（b）具有火焰离子化检测器的Varian 3800型气相色谱仪（目前为Varian是Agilent的一部分），（c）Rhyeodyne 6口阀（IDEX Health＆Sciences，Oak Harbor.WA）（d）一个实验室内清洗/灌装系统[36,37]。

2.2.熔融石英毛细管的水热预处理

使用气体压力操作的吹扫/填充系统[36]在10psi下，用2mL二氯甲烷，甲醇和水冲洗1米熔融石英毛细管段（250mu;m i.d.）。然后使用氧 - 乙炔密封毛细管的两端

火炬。将密封的毛细管置于GC烘箱中，通过以1℃/ min的速率将温度从40℃升至350℃进行调理，将毛细管在350℃保持200分钟。热调节后，将毛细管冷却至室温，并使用氧化铝晶片在两端切开。然后将其放置在GC烘箱中，其一端连接到GC注入口，允许氮气流过毛细管，另一端保持打开并固定在GC柱箱中。毛细管的热调节在氮吹扫（1mL / min）下进行如下：（40℃-80℃，速率为10℃/ min，120℃保持时间为350℃）。然后将毛细管冷却至室温，其内表面准备涂布。

2.3.通过非水解溶胶 - 凝胶（NHSG）路线制备溶胶 - 凝胶氧化锆 - PPO涂层毛细管

2.3.1.溶剂干燥

在NHSG工艺中，溶剂必须不含水。为此，溶剂（丁醇，甲苯）是分离的分子筛（4A型），通过将15mL的各种溶剂置于单独的小瓶中。 将10g量的分子筛加入到每种溶剂中并涡旋2分钟，然后在罩内气密地过夜。 将每个处理的溶剂的2mL等分试样转移到微量离心小瓶中并进行离心（10,000rpm 2分钟），以消除分子筛颗粒中任何可能的污染。为了测试干燥溶剂是否仍然含有水，将0.5g无水硫酸铜（白色）与1mL各干燥溶剂混合，然后将混合物充分涡旋。将混合物离心以沉淀硫酸铜粉末，其在水的存在下变蓝。重复干燥过程，直到没有观察到CuSO 4的颜色变化。

2.3.2.用四氯化锆改性有机聚合物

在制备溶胶 - 凝胶吸附剂之前，用四氯化锆改性聚环氧丙烷（PPO）的末端羟基。为此，将PPO和ZrCl 4以1:2（PPO：0.6mmol，ZrCl4：1.2mmol）的摩尔比在25mL圆底烧瓶中取出并溶解在无水甲苯（300L）中。将该溶液搅拌12小时60℃，然后在将其用于溶胶溶液的制备之前，使其达到室温。

2.3.3.NHSG路线溶胶溶液的制备

溶胶溶液如下制备：在聚丙烯离心小瓶中，将46mg四氯化锆溶解在74L干燥的1-丁醇中。 在第二个小瓶中，将80mg改性PPO与180L干燥的甲苯混合并充分涡旋1分钟，并将其留在罩中6小时。然后将聚合物溶液涡旋1分钟，然后转移至 第一瓶含有四氯化锆的丁醇溶液。将混合物充分涡旋以确保均匀性。 该合物的凝胶化时间为〜2h。基于该凝胶化时间，在将溶液在小瓶中进行反应30分钟后进行毛细管的涂层，使毛细管内进一步反应。

2.3.4.通过NHSG路线制备CME-HPLC的CME涂层

溶胶 - 凝胶涂层技术的细节可以在别处找到。[37]简言之，使用压力操作的填充/净化系统在15psi氮气压力下涂覆用水溶液处理的熔融石英毛细管60cm的溶胶溶液。在几滴溶胶溶出液从毛细管中出来之后，用橡胶隔膜密封毛细管的出口端。将溶胶溶液置于毛细管中30分钟。在毛细血管停留期结束时，毛细管的液体含量在15-psi气压下排出，留下毛细管内表面上的溶胶 - 凝胶涂层。制备了9个毛细管，毛细管停留时间不同（毛细管停留10分钟，5分钟增加时间），以优化最佳涂层条件。将涂覆的毛细管在GC烘箱中热调节，同时用氮气流吹扫。为此，毛细管的一端连接到GC注射口，另一端固定在GC柱箱中。使用温度程序（40℃-150℃，1℃/分钟，150℃保持300分钟）加热毛细管。将条件毛细管冷却至室温，并借助清洗/灌装系统用2毫升正丁醇和甲醇冲洗。最后，将涂覆的毛细管在氮气吹扫（40℃-150℃，5℃/分钟，在150℃下保持时间为300分钟）的GC烘箱中进行热调节。此时，涂覆的毛细管准备进行CME-HPLC实验。

2.4.通过水解溶胶 - 凝胶（HSG）路线制备溶胶 - 凝胶氧化锆 - PPO涂层毛细管

2.4.1.HSG路线溶胶溶液的制备

溶胶溶液如下制备：在聚丙烯离心小瓶中，将70L丁氧基锆与17L冰醋酸混合。在不同的小瓶中，将80mg改性PPO与200L 1-丁醇混合并充分涡旋1分钟，并在罩中留下6小时。然后将聚合物溶液再次充分涡旋1分钟，然后转移到含有丁醇锆和冰醋酸溶液的第一小瓶中。将混合物充分涡旋2分钟，向混合物中加入8L去离子水，然后彻底涡旋2分钟以确保溶胶 - 凝胶溶液的均匀性。该混合物的凝胶化时间约为8小时。考虑到这一事实，溶胶溶液首先被允许在小瓶中进行反应6小时，然后将其用于涂覆CME毛细管。

2.4.2.通过HSC途径制备CME-HPLC的CME涂层

用于通过HSG途径制备溶胶凝胶CME的毛细管涂层和调节程序类似于上一节中关于NHSG路线所描述的那样。

2.5.毛细管微萃取耦合到高效液相色谱（CME-HPLC）

CME-HPLC实验装置在其他地方描述。[22]简而言之，将40厘米的溶胶 - 凝胶涂覆的CME毛细管作为外部取样环安装在6端口HPLC注射阀上。用0.1M HCl连续稀释制备儿茶酚胺和5-羟色胺储液，得到1mg / L浓度水平。对于合成尿液溶液（合成尿的组成参考文献[38]），多巴胺和肾上腺素的浓度为1mg / L。用于CME实验的样品分别在水性和合成尿液样品的氢氧化铵溶液（pH 10.5）中以100g / L和200g / L浓度水平制备。将加标的尿液溶液涡旋1分钟，并以21,000g超速离心2分钟。使用甲醇通过连续稀释至1mg / L制备其他测试探针的储备溶液。使用去离子水将这些溶液进一步稀释至100g / L。在注射阀的“取样”位置，允许水样品通过实验室设计的重力给料样品分配器[37]通过注射阀通过CME毛细管。当样品通过毛细管时，通过溶胶 - 凝胶涂层在毛细管内壁上提取分析物。提取40分钟后，通过将阀切换到“注入”位置开始HPLC分析，从而通过HPLC流动相（A相：甲醇，B相：乙酸铵20mM，pH 3.8）的混合物解吸提取的分析物）流经毛细管并将其转移到HPLC柱（Zorbax C18 2.1times;150mm，5mu;m）。为了分析儿茶酚胺，对于测试探针（30/70 v / v％相A：B相），流动相组成（2/98 v / v％相A：B相）。对于合成尿液样品的分析，在CME-HPLC实验之间用流动相（90/10 v / v％相A：B相）冲洗柱子10分钟，以清洗HPLC柱在下一次CME-HPLC分析之前用流动相（2/98 v / v％相A：B相）平衡10分钟。

2.6.合成溶胶凝胶材料的表征

2.6.1.描述

对HSG和NHSG ZrO2-PPO吸附剂进行了FTIR和热分析分析。为此，将新鲜制备的溶胶溶液（如前述部分所述）与在微量离心小瓶中的水热预处理的5m直径的二氧化硅颗粒（0.2g，5w / w％的溶胶溶液）混合并涡旋2分钟。使用制备的混合物按照与用于制备的先前部分所述的非常相似的涂布/调节方法来涂覆硼硅酸盐管的内表面（3.6times;6mm）

的溶胶凝胶CME毛细管。经热处理后，用不锈钢刮刀将溶胶凝胶材料刮去管表面，并用于FTIR和TGA分析。

2.6.2.涂层厚度和体积

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