摘 要

本文利用琼脂的温度刺激响应溶胶凝胶转变性能，以及阳离子聚电解质壳聚糖和阴离子聚电解质羧甲基纤维素之间的静电相互作用，通过一步法制备得到了内层为小球，外层为胶囊的小球/胶囊双层载体材料。首先对内层和外层的粒径比进行了探究实验，内外径之比随着琼脂溶液和壳聚糖溶液体积比的减小不断减小。然后对该载体材料的形貌、包埋及释放性能进行了研究。实验表明该载体材料，可以用于包埋不同类型物质（荧光物质和药物等），并且可以通过将药物分别包埋在小球/胶囊双层载体材料的内层和外层达到控制释放的目的。该小球/胶囊双层载体材料在荧光标记和控制释放等领域将具备良好的应用前景。

关键词：琼脂；壳聚糖；羧甲基纤维素；载体材料

Abstract

In this paper, the temperature stimuli response sol-gel transition of agar, the electrostatic interaction between the cationic polyelectrolyte chitosan and the anionic polyelectrolyte carboxymethylcellulose is used to prepare the natural polymer microspheres/capsule double-layer structure carrier material by one-step method. Firstly, the particle size ratio of the inner and outer layers of the capsule was explored.The ratio of inner and outer diameters decreases as the volume ratio of agar solution and chitosan solution decreases. Then the morphology, embedding and release properties of the support material were investigated. Experiments have shown that the carrier material can be used to embed different types of materials,such as fluorescent substance and drugs.This material can achieve controlled release by embedding the drug separately in the inner and outer layers of the microspheres/capsule double-layer carrier material.The microspheres/capsule double-layer carrier material have good application prospects in the fields of fluorescent labeling and controlled release.

Key Words：Agar；Chitosan；Carboxymethyl cellulose；Carrier material

目 录

第1章 绪论 1

1.1 天然高分子材料简介 1

1.1.2 琼脂 1

1.1.3 壳聚糖 2

1.1.4 羧甲基纤维素 3

1.2 天然高分子药物载体材料的研究进展 3

1.2.1 羧甲基纤维素药物载体 3

1.2.2 琼脂药物载体 4

1.2.3 壳聚糖药物载体 4

1.2.4 载体材料的制备方法 5

1.3 双层结构载体材料 6

1.4 本课题的目的及意义 7

第2章 实验 8

2.1 实验材料及设备 8

2.2 小球/胶囊双层载体材料的制备 10

2.3 小球/胶囊双层载体材料的内外径之比 10

2.4 小球/胶囊双层载体材料的扫描电子显微镜测试 11

2.5 小球/胶囊双层载体材料的切开 11

2.6 小球/胶囊双层载体材料的包埋实验 11

2.7 小球/胶囊双层载体材料的释放实验 12

第3章 结果与讨论 13

3.1 小球/胶囊双层载体材料的制备 13

3.2 小球/胶囊双层载体材料的内外径之比 14

3.3 小球/胶囊双层载体材料的SEM形貌分析 14

3.4 小球/胶囊双层载体材料的切开 15

3.5 小球/胶囊双层载体材料的包埋实验 16

3.6 小球/胶囊双层载体材料的释放试验 17

第4章 总结 19

参考文献 20

致谢 23

第1章 绪论

1.1天然高分子

1.1.1天然高分子概述

上世纪以来，随着合成高分子产业的迅速发展，合成高分子已经广泛应用于人类生活的方方面面。然而合成高分子的生物可降解性较差，在土壤中几十年都无法降解，然而大多数合成高分子制品质软并且易破碎，废弃的合成高分子分散在土壤、河流和海洋中，会对生态环境带来破坏。因此，近年来，越来越多科研工作者在研究用生物质替代传统化学工业的中用石油和煤制得的合成高分子。天然高分子广泛来源于微生物、动植物体内，具有良好的生物可降解性，能被微生物分解成CO₂和水等小分子，因此天然高分子的开发与应用得到了重视^[1]。

天然高分子具有来源广泛、良好的生物可降解性、良好的生物相容性低毒或无毒等特点和优点，以天然高分子作为原料合成的材料基本上都具有生物可降解性。天然高分子的分类主要有以下几大类^[2]：多糖类：淀粉、果胶、纤维素、透明质酸、甲壳素、壳聚糖、黄原胶、果聚糖；蛋白质类：丝蛋白、弹性蛋白质、酪蛋白、血清蛋白、胶原蛋白、聚赖氨酸；其他：木质素、天然橡胶、紫虫胶、乙酸甘油酯。

1.1.2琼脂

琼脂是异质半乳聚糖的混合物，含有琼脂糖和琼脂果胶两种成分。其中作为胶凝剂的琼脂糖是一种不含硫酸酯的非离子型多糖，是形成凝胶的组分；而琼脂果胶，是一种带有硫酸酯、葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的复杂多糖，是非凝胶的组分，在加工工艺中一般将其除去。琼脂主要来源于各种藻类，由3,6-脱水-1-半乳糖（或1-半乳糖-6-硫酸盐）、d-半乳糖和1-半乳糖组成，β-半乳糖或（β-半乳糖-6-硫酸盐）通常以3,6-脱水形式，以β-（1,4）和α-（1,3）键交替连接^[3]。科研工作者在海水中发现了一种可以将琼脂分解为碳能源的微生物，这些微生物可以产生琼脂酶催化降解琼脂^[4]。

琼脂极易溶于水，能够吸收的水分大约是自身体积的20倍。并且琼脂具有温度刺激响应溶胶凝胶转变性能，即溶于水的琼脂在温度上升至95℃时以溶液形式存在，温度降至40℃以凝胶形式存在。琼脂在日用化工、生物工程、医药食品等方面有着广泛的应用。

在生物工程领域，制作微生物培养基的过程时，为了使液体培养基转化成固体或半固体培养基，通常可以向培养基中添加一定量的琼脂；在向未凝固的琼脂培养基中接种微生物时，微生物不会产生高温下蛋白质失活的现象；待其凝固后，再进行升温，高温下（不高于95℃）培养，培养基不会熔化，能够很好地满足生物实验的各种温度要求^[5]。

在食品工业领域，由于琼脂的凝胶特性，琼脂可以用作食品增稠剂或乳化剂，广泛应用于制造罐头食品、凉拌食品、果冻、饮料、肉制品糕点和羹汤等。不仅如此，琼脂还具有络合作用，利用该性质将琼脂添加到食品中可以起到装饰产品、改善口感的作用，例如它可以与饮品中影响外观和口感的一些物质络合沉淀，使饮品具有更好的口感并且外观澄清、色泽鲜艳，为产品增添特色。琼脂还具有解暑清热、健脾开胃的功能，对人体十分有益^[6]。因其独特的温度刺激响应性溶胶凝胶转变，琼脂也常与其他天然大分子一起用以合成药物载体。

1.1.3壳聚糖

壳聚糖是天然多糖甲壳素脱乙酰化的产物，是一种是白色或灰白色的，无味，安全无毒的片状或粉状固体。甲壳素是自然界高分子中含量第二多的天然高分子，来源十分广泛，主要来源于甲壳类动物的外壳，也存在于一些低等植物的细胞壁中，甲壳素的化学式为1,4-2-氨基-2-脱氧-β-D葡萄糖^[7]。壳聚糖分子中存在羟基，可以发生以下多种化学反应：氧化反应、还原反应、络合反应、磺化反应和水解反应等。壳聚糖具有良好的生物相容性、无毒或低毒使得它广泛地应用与日用品、农业、生物医药等领域。

在日用品领域，壳聚糖因其抑菌、吸湿的特性，适用于之别洗面奶、沐浴露、保湿霜和乳液等产品。可以帮助皮肤代谢重金属，提高患病区域皮肤的免疫能力，还可以快速修复医美手术对皮肤造成的轻微性热伤害和过敏反应。它就相当于一种天然抗生素来防止伤口发炎、促进皮肤愈合，修复皮肤屏障。

在农业领域，壳聚糖的粗产物富含微量元素，因此它是畜牧业的优质饲料。壳聚糖富含氮元素，是天然的氮肥，可以作为农作物的生长促进剂，加强农作物的光合作用，从而提高农作物产量。用其制成的肥料还可以给农作物抗菌、杀虫，同时分解土壤中的生物体残余，使得土壤更肥沃并且增强作物的免疫力。

在生物医用领域，壳聚糖可以帮助皮肤代谢，提高患病区域皮肤的免疫能力，还可以快速修复医美手术对皮肤造成的轻微性热伤害或者过敏反应。壳聚糖容易加工成型，并且具有抑菌功能、透气效果和凝血，因而适合应用于医用缝合材料和外伤伤口填料，并且壳聚糖在人体内环境中可以被溶菌酶等物质降解进而吸收，是一种十分理想的无毒害医用材料。壳聚糖与其他物质复合后形成的材料可以替代骨质，用于制造牙齿，甚至可以充当人造血管和人造皮肤，在生物工程领域具有广泛的应用前景^[8]。壳聚糖因为具备良好的生物相容性，可以用于药物载体材料，例如基因载体、药物控制释放载体、抗肿瘤药物靶向载体^[9,10]。基因载体可以用作癌症的基因免疫疗法，将所运载的基因靶向输送至肿瘤细胞，对其进行基因修改。作为缓控释放药物载体，壳聚糖一般与其他聚阴离子交联形成稳定结构从而实现缓控释放。作为肿瘤药物靶向载体，壳聚糖制成的纳米微粒因为粒径小并且药物溶解度高，可以靶向被动作用于病灶，提高药效。

壳聚糖是一种阳离子聚电解质，通过络合作用可以发生离子交换，能够吸附重金属离子以及一些生物质小分子污染物，因此可以利用壳聚糖处理重金属废水，甚至可以用来精制饮用水，净水效果十分优异。类似的，壳聚糖可以吸附许多诸如胆固醇、甘油三酯、钙、汞、铀等小分子，可以帮助人体进行有害物质的代谢以及治疗血管疾病。它还可以通过氨根离子基团对氯离子的吸附能力，对氯离子进行排泄，从而预防和控制高血压。

1.1.4羧甲基纤维素

羧甲基纤维素是纤维素经羧甲基化得到的白色或微黄的絮状纤维粉末，即纤维素经NaOH处理形成碱纤维素，再用酸溶液处理所得。羧甲基纤维素是一种无毒无味，可溶于水的天然高分子衍生物，它形成的透明溶液具有一定的粘度，该溶液具有吸湿性和光热稳定性，粘度随着温度升高而降低。羧甲基纤维素是一种阴离子聚电解质，配成的溶液为中性或弱碱性。纤维素有葡萄糖缩合组成，其上有多个可被置换的羟基，这样就有不同置换度的产品。置换度最终影响成品的溶液粘度。

羧甲基纤维素可以作为增稠剂、乳化剂、稳定剂和粘合剂等制剂进行使用。在建筑领域，羧甲基纤维素可用来作为陶瓷的胶黏剂和可塑剂，釉面的固色剂，可以提高建筑的保水性和强度。在日用化工领域，羧甲基纤维素可通过制成洗涤剂发挥其吸附作用，并且不会对水环境造成影响，还可用来制作牙膏的胶质基体^[11]。将羧甲基纤维素交联后，制成滤膜可以用来处理工业废水。在纺织行业，羧甲基纤维素可作为上浆剂，帮助固色；在造纸行业，可作为施胶剂，提高纸张的撕裂强度和柔韧性。在食品领域，可用于食品的增稠剂和稳定剂，提升口感。羧甲基纤维素因为是一种具有生物相容性的阴离子聚电解质，因此可以和阳离子聚电解质发生静电相互作用形成复合膜用于制备药物载体材料^[2]。相似地，将羧甲基纤维素作为农药的缓释载体，可以减轻对土壤以及水环境的污染^[12]。

1.2天然高分子载体材料

传统药物体系在人体内的释放存在周期性，因其浓度不受控制，很容易产生副作用，药物的利用率也不可避免得降低。载体材料的出现，避免了以往药物体系的这些弊端，提高了药物利用率。载体材料在长久以来的探索和应用中产生了形态各异的结构，比如微球，微胶囊，丸剂等^[13]。为了使包埋的药物能够很好地发挥效用，一般选择具有无毒无害，良好的生物可降解性和良好的生物相容性天然高分子作为制备载体材料的原料。现在常用于制备载体材料的天然高分子有多糖类、蛋白类以及一些衍生物。多糖类如琼脂、纤维素、淀粉和壳聚糖等，蛋白质类诸如明胶、丝素蛋白和白蛋白等。

1.2.1羧甲基纤维素载体材料

羧甲基纤维素是纤维素经羧甲基化得到，具有来源广泛、价格低廉和良好的可生物降解等特点。Mu等人^[14]用胶原蛋白肽修饰羧甲基纤维素（CMCC）制备了抗炎药物载体，体外研究表明CMCC促进了H₂O₂处理坏死细胞的能力，能够对抑制细胞凋亡起到非常明显的效果，可用于治疗视网膜的细胞损伤。Monireh等人^[15]用六水合氯化铁将氧化石墨烯和羧甲基纤维素进行物理交联，得到具有pH刺激响应，在中性条件下(pH为6.8)均匀释放的抗癌药物多柔比星（DOX）的药物载体，其形态为复合纳米水凝胶微粒。Barun等人^[16]原位形成的金纳米粒子掺入羧甲基纤维素和聚甲基丙烯酸交联体，得到了无细胞毒性、渗透能力增强、生物可降解的新型纳米水凝胶药物载体材料，对药物双氯芬酸钠（DFS）和盐酸地尔硫（DHL）实现了良好的控制释放。

1.2.2琼脂载体材料

琼脂具有生物可降解性，无毒等特点和优点，用于制备载体材料时可以很好地维持载体基质的稳定性，从而保证药物宝阿米的稳定性。Miguel等人^[17]将银离子络合物与琼脂合成得到了一种新型复合水凝胶，经研究表明，该复合水凝胶定性地展现了靶向输送能力，能够很好的定向治疗表皮以及皮下软组织的微生物感染。Wu等人^[18]将MoS₂/Bi₂S₃-PEG（MBP）、琼脂和抗癌药物多柔比星（DOX）分散在水中，制得了一种可注射包埋抗癌药物DOX的复合水凝胶，该水凝胶能够同时用于肿瘤光热疗法和化疗；琼脂/MBP/DOX复合水凝胶又可以将抗癌药物和MBP固定，防止他们进入体液循环；治疗过程中MBP的光热转化的热量使得药物从复合水凝胶中释放，从而实现控制释放。Jaleh等人^[19]通过离子凝胶化将抗抑郁药物盐酸安非他酮包埋在琼脂纳米球中，纳米球包埋的药物的利用率高达90%；将该纳米球制成喷雾，作用于肺部，释放研究表明通过此方法制备得到了抗抑郁药物的靶向输送和高效释放的载体材料。

1.2.3壳聚糖载体材料

壳聚糖是一种含氮多糖类天然高分子，它的分子链中含有大量的活性氨基和羟基，可用于制备药膜药片或微粒微球。Tanimoto等人^[20]用聚丙烯酸作为粘合剂通过生物矿化过程制备壳聚糖-碳酸钙核壳型复合微球，该微球壳层具有方解石晶体结构，在宽范围pH条件下测试该载体的释放行为，结果表明，无机壳层对释放有抑制作用，但无机物的晶型对这种抑制作用有影响。Hossein等人^[21]用壳聚糖包埋柠檬酸改性的四氧化三铁纳米粒子通过热分析和光谱分析，明确得到了可以有效负载和缓释抗癌药物的较高负载率和包封率的载体材料。Sah等人^[22]用纤维、微粒、薄膜等形态的壳聚糖药物载体将药物递送至牙周袋，在治疗期内，以低剂量定点长时间高浓度靶向释放，减少毒副作用，提高治疗效率，并且由于壳聚糖的保湿作用可以诱导组织愈合，显著提升药效。Akolade等人^[23]将壳聚糖通过三磷酸盐离子凝胶化或与藻酸盐聚电解质络合制备包埋了姜黄素的药物载体，该载体的包埋率和药物释放行为受交联时间、环境酸碱度以及试剂浓度影响。Kamaraj等人^[24]通过席夫碱反应制备用于包埋姜黄素香草醛-壳聚糖复合载体，并向其中添加具有超顺磁性钙铁氧体纳米颗粒，上述独特的工艺使得该载体具有了极高的包埋率和良好生物相容性。

1.2.4载体材料的制备方法

常用的载体材料的制备方法有交联法、盐析法、聚合法、喷雾干燥、超声法和相分离法等。

交联法：Su等人^[25]在室温催化条件下，用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺作交联剂，通过乳化交联法合成羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖接枝聚乳酸水凝胶药物载体。Wang等人^[26]用钙离子将羧甲基纤维素，壳聚糖和氧化石墨烯交联形成复合气凝胶，作为药物载体输送抗癌药物5-氟尿嘧啶，得到了pH响应的控制释放体系。

盐析法：Wijaya等人^[27]用硫酸溶液处理百香果外皮纤维素片段，从天然产物中提取纤维素纳米晶体，用作包埋四环素抗生素药物的载体，由于纤维素纳米晶体优异的理化性质，药物在弱碱和酸性的体温条件下展现出优异的释放性能。

聚合法：Tanushree等人^[28]将聚D，L-丙交酯-共-乙交酯作为模板，通过单乳液聚合法制备了中空的壳聚糖纳米微球，该微球具有低密度和高表面积。Akolade等人^[23]将壳聚糖通过三磷酸盐离子凝胶化或与藻酸盐聚电解质络合制备了包埋姜黄素的药物载体。

喷雾干燥法：Norul等人^[29]以天然玉米淀粉为原料，通过酸水解和热湿处理将支链淀粉脱支链转化成直链淀粉，从而产生抗性淀粉，加强了无定形相之间的氢键和凝胶化，再经过纳米喷雾干燥得到纳米载体。

1.3双层结构载体材料

一般包埋的药物在载体材料的基质中是均匀分散的，在释放时，分散在载体材料表面的药物与外界接触会直接释放，不利于药物控制释放，构建具有双层结构的载体材料就可以减缓这种弊端。Daniele等人^[30]制备了用于包埋白藜芦醇的内层是玉米醇溶蛋白，外层是壳聚糖的纳米载体材料；研究表明，该双层载体相较于单层的玉米醇溶蛋白载体材料，白藜芦醇在模拟肠液中的释放行为得到了改善，实现了双相释放和缓控释放，该载体可以潜在地应用于口服给药载体。Laura等人^[31]利用壳聚糖上的氨基将壳聚糖接枝在聚乙二醇表面，形成纳米胶囊结构；并且对于内层包埋的药物的毒副作用有明显的调节作用，研究表明，外层壳聚糖覆盖密度越高，药物对外界的毒副作用越低。Su等人^[32]用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，在室温条件下合成了聚乳酸/羧甲基壳聚糖载体材料；研究表明，该载体材料具有良好的血液相容性和细胞相容性，在皮下组织可以完全降解；而且将该载体材料包埋药物用于炎症，发现炎症也完全消失，说明该载体材料的药物利用率十分优异。余俊^[33]等人将阴离子聚电解质透明质酸和阳离子聚电解质壳聚糖通过静电相互作用结合形成具有双层结构的纳米颗粒载体材料，该颗粒在PBS中仍可以保持长期稳定；研究表明，可以将CD47抗体包埋于该载体材料上用于治疗动脉粥样硬化，说明该载体材料可以潜在地应用于靶向给药系统。Zhong等人^[34]通过声化学方法制备了叶酸（FA）功能化还原反应磁性壳聚糖（CS）纳米胶囊（FA-RMCNCs），将靶向分子叶酸、红色荧光探针（罗丹明B异硫氰酸酯）和硫醇化四氧化三铁磁性纳米粒子固定在胶囊外层，使得载体显示出磁响应，这种双层结构的胶囊在叶酸的作用下可被细胞选择性内化，并且可以实现疏水性药物的控制释放。Tian等人^[35]通过静电吸附制备了双层结构的羧甲基壳聚糖/季铵壳聚糖-脂质体载体材料，将姜黄素包埋于羧甲基壳聚糖/季铵壳聚糖-脂质体双层载体材料上，研究表明载体的双层结构使得药物在机体内的循环时间得到延长，该双层载体材料在口服药物方向有潜在的应用价值。

1.4本课题的目的及意义

天然高分子具有绿色环保、低毒或无毒和良好生物可降解性等特点和优点，在食品、和生物医用等领域有着广泛的应用。本论文以天然高分子琼脂、羧甲基纤维素和壳聚糖作为原料，利用琼脂的温度刺激响应溶胶凝胶转变性能，以及壳聚糖和羧甲基纤维素的静电相互作用，采用一步法制备得到内层为琼脂小球，外层为壳聚糖和羧甲基纤维素胶囊的小球/胶囊双层载体材料。并对该小球/胶囊双层载体材料的形貌、包埋和释放性能进行了研究。这些小球/胶囊核壳载体材料具有分层结构，可以分层包埋不同种类的物质，并且被包埋的荧光素钠可以保留其原有的绿色荧光。在释放方面，可以通过将药物分别包埋于小球/胶囊双层载体材料的内层和外层达到控制释放的目的。本论文为新型结构得天然高分子载体材料的制备及应用研究提供了重要的理论和实践依据，制备的小球/胶囊核壳载体材料在荧光标记和控制释放等领域将具备良好的应用前景。

第2章 实验

2.1实验材料及设备

本实验用到的主要药品和试剂如表2-1所示：

表2-1 主要药品和试剂

注：BC表示生化试剂；CP表示化学纯；AR表示分析纯；BS表示生物染色剂

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