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刺激响应性的C2-环己烷衍生类凝胶的高效自组装行为研究

Chuan-Liang Feng,* Xiaoqiu Dou, Di Zhang, Holger Schouml;nherr

有文章报道了基于C2-1,4-二酰胺环己烷的低分子量凝胶因子（LMWG）的结构设计和合成。由于该凝胶因子具有高对称性，最初凝胶因子在溶液中分布良好，并且在自组装前没有形成聚集体。随后的自组装过程形成了通用凝胶，这个自组装过程十分高效，并且对溶液的pH有强烈的依赖性和响应性。研究发现不同凝胶的自组装与LMWG上相应的功能性取代基团的pKa值密切相关。原代细胞培养实验表明在仿生条件下制成的水凝胶有希望作为可人为设计的一种微环境。

1.介绍

合成水凝胶可以用于测定某些特定微环境中的细胞的功能，可以通过改变单个变量而产生不同的效果 ^[1] 。微环境可以通过利用合成材料的自组装来构建用于细胞培养的细胞外基质（ECM）的模拟物来产生^[2] 。凝胶自组装的质量在向这些微环境中引入单一变量方面起着非常重要的作用。为了精确地引入某个变量，需要合成材料进行高效的自组装，这对细胞与环境的连接以及细胞因子和营养物质的最佳扩散是不可或缺的^[3] 。

最近，人们对通过合成低分子量凝胶因子（LMWG），并使其自组装来自发形成水凝胶感兴趣^[4-9] 。LMWG具有特别的意义，因为自组装来源于非共价相互作用，例如氢键，疏水相互作用，pi;-pi;堆积和静电相互作用 ^[10,11]，与聚合物支架形成不同^[12]，这有利于通过使用热，pH或酶触发自组装以形成纳米纤维水凝胶。其中，由于易于控制凝胶性质，pH触发自组装应用最广。虽然已经研究了不同pH环境中的LMWG与pH值的最佳组合，但迄今为止，控制溶液pH值微小变化来引发自组装行为还是十分具有挑战性的^[13-17]。主要原因是因为大多数LMWG都具有高度疏水性的衍生物，例如，N-末端芴基-9-甲氧基羰基二肽，导致pKa因为结构的不同而产生显著的变化 ^[18]。这导致在自组装之前就形成了动力学捕获的聚集体^[19]。捕获的聚集物使得单个胶凝因子分子溶液具有十分敏感的PH响应性，直接影响随后的自组装效率。这一问题急需解决，因为高效自组装对于这些胶凝因子的应用十分重要，例如在用于细胞培养的多功能微环境领域。

2.实验部分

2.1材料

所有化学品购自Aldrich并且在没有进一步纯化的情况下使用。 化合物的合成过程在误差允许范围内。双蒸馏，脱氧水用于实验全过程。

2.2滴定实验

通过使用适量的HCl水溶液将M1，M2，M3，M4和M5溶解在水溶液中，最后凝胶因子浓度为15times;10 ^-3 M。通过使用一定量的NaOH溶解M6。“滴定”实验是通过向500mu;L M6溶液中逐步加入少量稀释的NaOH溶液至500mu;L的M1-M5溶液或HCl中而进行的。 每次加入后，先将样品充分搅拌以混合均匀，然后使其平衡约5分钟。在形成水凝胶之前和之后记录pH值。作为对照，也使用相同的方法滴定水。 2.3 纳米纤维涂布基材的制备

将凝胶在水中稀释至0.1times;10^-3M的浓度。将预清洁的硅或玻璃基底浸没在这些溶液中1至12小时。然后除去基底并在氮气流中干燥。

2.4DMEM中水凝胶的制备

制备溶液pH为5.0的M1（2M）浓溶液。使用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）稀释浓缩的M1溶液，得到从2times;10 ^-3 M至30times;10 ^-3 M的最终浓度。通过用移液管混合并等待几分钟，可以在仿生环境中获得稳定的M1水凝胶。通过相同方法术制备M2和M3水凝胶。

2.5细胞培养

使用人肝细胞肝癌细胞系（HepG2）（Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Japan）用于研究细胞在凝胶涂层和3D凝胶内部的培养过程。该细胞在用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO; Invitrogen Co.，USA）处理后，在37℃，5％CO ₂气氛下，在组织培养的聚苯乙烯皿中进行常规传代培养。用于HepG2的培养基含有丙酮酸钠和非必需氨基酸（ICN Biomedicals，Inc.，USA），含有高葡萄糖（4.5g L -1），补充有10％热灭活的胎牛血清（FBS），1％青霉素/链霉素（P / S）和碳酸氢钠（Wako Pure Chemical Industries Ltd.，Japan）。然后将5％（W）蔗糖溶解在DMEM中。

2.6.凝胶涂层上的细胞培养

M1，M2和M3用于细胞培养实验。将各培养基中的HepG2细胞以5times;10 ⁴的密度接种在凝胶表面上。将细胞在37℃下在5％CO ₂ -95％空气中温育。整个细胞培养过程长达1周的时间，每2天更换一次培养基。通过显微照相记录细胞粘附和增殖。

2.7.LMWG的细胞毒性

在37℃下将细胞在凝胶中/上部培养过夜。每孔向样品中加入4微升裂解缓冲液（乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒），并在37℃下孵育1小时。 然后，将来自每个孔的100mu;L培养基（2-3次移液上下之后）小心地移出并转移至其它96孔板。 将100微升LDH试剂加入100微升样品中，并在37℃下孵育30分钟。 最后，加入终止液（50mu;L），通过荧光光谱在560 / 590nm测量荧光。

2.8.原子力显微镜和紫外可见光吸收光谱

使用100微米扫描仪和微制造的氮化硅尖端/悬臂（Nanoprobes，Digital Instruments / Veeco），用NanoScope III多模AFM（Digital Instruments / Veeco，Santa Barbara，CA）进行原子力显微镜扫描（AFM） （约30％相对湿度，24℃）。使用二极管阵列Tecan Infinite 200M pro UV-Vis光谱仪收集吸收光谱。在200和600nm之间的波长区域中记录透光度，吸光度和反射率。

3结果与讨论

水凝胶因子通过收敛或发散合成路线来合成。图2.（a）M1和（b）M4的纳米纤维的SEM图像;纳米纤维的TEM图像（c）M1和（d）M4^[20] 。C2-环己烷核与生物相容的氨基取代基对称偶联。通过NMR（图1，支持信息）表征了环己烷核的1和4位上甘氨酸（Gly），组胺（His），赖氨酸（Lys）或乙二胺（Ethy））的对称结合。双取代化合物的有效转化可归因于合成过程中C2-芯的低空间位阻。

分别以苯丙氨酸（Phe），甲硫氨酸（Meth）或亮氨酸（Leu）作为侧基和pH响应性Gly，His，Lys或Ethy作为功能取代基合成6种凝胶因子（M1-M6）。 侧链基团具有疏水特性，这对于水凝胶十分重要^[21]。

另一方面，氨基取代基有助于凝胶通过各酰胺部分之间的分子间氢键来提高稳定性。 这些非共价相互作用可以提供强的，自互补的和单轴的分子间相互作用，这对于将1D自组装成纤维聚集体是必需的，因此凝胶化可以发生^[22,23]。疏水相互作用和氢键的组合可以稳定这种纳米纤维水凝胶的二级结构

LMWG引入pH响应性氨基取代基使其可以通过改变溶液pH来制备水凝胶。 M1溶解在酸水溶液中，加入碱导致在玻璃小瓶中形成硬凝胶。加入酸后，再次恢复为清澈的溶液（图2，支持信息）。同样的，可获得M2-M5的水凝胶。相比之下，M6只能溶解在碱性水溶液中，在加入酸时形成的凝胶。在滴定实验中确定的临界凝胶化浓度为约0.16％，0.21％，0.26％，0.06％，0.13％ ，对于M1，M2，M3，M4，M5和M6分别为0.25％。

在滴定实验中，一旦溶液pH升高到asymp;7.4（即，高于His取代基的pKa（asymp;6.1））^[24]，发现M1形成硬凝胶^[25]，当pH降低到asymp;3.5时形成澄清溶液。凝胶因子M2和M3得到类似的结果。相比之下，当pH升高到asymp;12.0时，M4形成硬凝胶，高于Lys取代基的pKa（asymp;10.8）（图3，支持信息）^[26] ，溶液在asymp;4.0的pH下变得澄清。 M5（Ethy：pKa =asymp;10.0）在pH约为11.5时形成硬凝胶，一旦pH降至asymp;4.0，就形成澄清溶液。 由于Gly中羧酸的低pKa（asymp;3.6），在pH为asymp;2.0时形成M6的硬凝胶，并且在asymp;8.0的pH下出现澄清溶液。 形成用于M1-M6的硬凝胶或澄清溶液所需的pH总结在表1中。 很明显，自组装行为与氨基取代基的pKa密切相关。为了表征水凝胶，将其用纯水稀释至最终浓度为0.1times;10 ^-3 M。通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）研究M1和M4的纳米纤维的形态 。发现纳米纤维束的宽度在100-500nm的范围内，这在ECM组分（10-500nm）报道的范围内（图2a和b）^[21a]。通过TEM发现 M1和M4纳米纤维具有单独的纤维直径和长度分别为6-12 nm和几十微米（图2c和d）。 凝胶纤维的高纵横比表明胶凝因子分子之间的分子间相互作用是高度各向异性的。

纳米纤维的FTIR光谱表明NH的伸缩振动在3350-3250cm ^-1的范围内，来自-CO-的信号在1660和1630cm ^-1之间，这是氢键合的次级酰胺（图4，辅助信息）^[27]。在纳米纤维中氢键结合的仲酰胺的形成使得可以通过改变pH在分子水平调节纳米纤维组织。通过AFM（图5，支持信息）表征M1纳米纤维的可逆组装和拆卸性能。

图3a中显示的UV-Vis光谱显示了在不同溶液pH（类似于M2-M5）下M1自组装的变化。在pH 7.4，纤维堆叠结构的特征在于在308nm处出现的最大吸收峰。这个峰位置是由于自组装结构中邻苯基团之间的--相互作用，苯环的红移吸收引起的（图3c左）。当pH降低时，观察到两个等吸光点，这表明原始结构逐渐改变（其显示蓝移吸收）而没有中间（图3c中间）。最后在pH 3.5，观察到明显不同的光谱，这对应于拆卸的单个M1分子^[28]。 在pH 3.5，两个组胺臂被认为是完全质子化的。在这种情况下，带正电荷的酰胺部分之​​间的强排斥力，导致纳米纤维的完全拆解（图3c右）。与在较高pH下获得的数据相比，从光谱的偏差可以明显地看出分解，显示了两个等吸光点。

值得注意的是，降低pH后观察到的吸收最大值的蓝移可归因于两个氢键合酰胺部分的高度对称的平行取向。 由于两个相邻的LMWG分子之间的这种高效的相互作用或自组装，质子化的组胺臂可以改变酰胺部分之间的分子间氢键的平衡，稍微降低溶液pH lt;7.4，导致纳米纤维逐渐改变其结构。总之，我们可以说，溶液环境（pH）中的非常轻微的变化会导致自组装结构的响应，如通过图3a中的UV吸收光谱的微调特性所证实的。

CD光谱用于进一步研究自组装对溶液pH的反应（图3b）。 同时捕获的吸收光谱显示出低于240nm的强峰。在pH=7.4时，M1的CD光谱显示出与beta;片结构相关的218nm处的强峰。该峰在pH 3.5时消失，表明M1纳米纤维在低pH值下分解成单分子^[29]。有趣的是，当溶液pH=7.4时，分散的M1分子重新组装成纳米纤维，如CD光谱所证实的。该结果表明组件的热力学控制和可逆特性。

到目前为止，与文献报道的其他pH响应性LMWG相比，C2对称的环己烷核心基凝胶因子对溶液pH敏感的性能具有明显的不同。大部分凝胶因子倾向于在水溶液中自组装之前形成捕获的聚集体，最终导致平衡状态^[17-19]。根据在溶液中良好分布的单个C2对称凝胶因子分子的观察证明，没有捕获的胶凝因子在开始组装过程之前聚集在溶液中。这导致在相邻的胶凝因子分子之间有高效的相互作用并且依次有效的自组装。

具有明显的pH响应性的有效自组装将来在某些领域（例如细胞培养）具有极大的应用。如上所述，可以控制M1水凝胶在狭窄的生理pH范围内进行自组装。 这样的生理水凝胶可能被用作组织工程领域的ECM模拟物。为了证明这一点，缓冲介质（pH=7.4），选择含有5％蔗糖的DMEM^[30]。通过加入M1的浓缩水溶液（2M，pH 5.0）转化成DMEM，终浓度为2times;10^-3M至30times;10^-3M，得到稳定的M1水凝胶（图3a）。将测得的水凝胶的pH值对胶凝因子浓度作图（图4b），并发现在宽范围的起始浓度下在生理范围内。 M2和M3水凝胶也通过相同的方法制备。相比之下，M4和M5胶凝因子仅在DMEM中形成混浊溶液，推测是因为它们的pKa高。

通过使用CytoToxONE法来评估凝胶的毒性，CytoToxONE测定法是一种基于荧光的快速测定，从具有损伤膜的细胞中释放LDH。由于HepG2细胞具有上皮形态，因此选择了HepG2细胞进行该测试，这成为研究癌症和凋亡研究的非常有用的模型^[31]。 图4C显示了不同凝胶涂层表面上的细胞培养基和三个对照实验的荧光信号，即Matrigel，仅细胞和裂解细胞。 在三种不同的情况下测量细胞毒性，时间点在5天内。 实验显示，测试的M1，M2和M3凝胶支持细胞生长，并且与商业ECM模拟物Matrigel毒性相当，甚至毒性更小。

4结论

对于高对称性的基于1,4-二酰胺环己烷核的LMW

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