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用于载药的低分子量水性凝胶因子与抗癌药物之间的相互作用

我们研究了抗癌药物的尺寸，电荷和疏水性对其在L-丙氨酸基小分子水性凝胶因子中包埋功效的影响。我们描述了各种抗癌药物在水凝胶中的包埋，并且指出其与凝胶因子和药物分子之间的相互作用有关。在1.5％（w / v）水凝胶中，对5-氟尿嘧啶的最高包埋量高达1.2mg / mL; 而对于小的极性抗癌药物如顺铂和卡铂，包埋效果并不好。水凝胶还能够包埋和保留疏水性药物如多西他赛和他莫昔芬，具有高的药物装载效率。通过流变学和SEM来表征包埋药物的水凝胶，了解了药物对水凝胶组装的影响。药物释放和抗癌活性的研究显示药物从水凝胶中缓慢且持续的释放，这一现象有利于它们在未来癌症治疗应用方向上的探索。

前言

目前癌症化疗方案包括基于聚合物，脂质体或蛋白质基药物纳米颗粒的药物载体的使用，其有助于药物在血液循环中的控制释放，用于增强生物分布和改善药代动力学。这些癌症化疗方法具有很大的局限性，例如存在几种系统性毒副作用和在肿瘤部位的靶向较差，其需要改进的局部注射疗法，通过增强局部药物浓度和使系统毒性最小化，以及通过缓慢和持续释放减少剂量，这不可避免地会超过限制。

因为能够包埋并允许药物的缓慢和持续释放，水凝胶为现有的临床可用生物材料提供了合适的替代物。这些可注射的水凝胶具有在肿瘤部位释放药物和避免药物系统毒性的额外益处。在这一方面，由于低分子量水性凝胶因子（LMHGs）的低分子量和具有可以自组装成能够包埋药物并随后以持续的方式释放药物的机械坚固的凝胶的能力，LMHGs具有很大的吸引力。许多基于肽，半合成分子，碳水化合物或脂质的LMHGs载体已经被报道出来。与常规聚合物载体不同，这些LMHGs（M.W. lt;1000Da）容易合成并且具有已知的生物可降解途径，引起的副作用较少。这些LMHGs基本上依靠二级相互作用，如氢键，范德华力，pi;-pi;堆积和静电相互作用，使它们的自组装结构可逆。这些相互作用也有助于水凝胶包埋不同的可变电荷和疏水性药物。Sutton等人通过使用苯基丙氨酸和苯基酪氨酸凝胶进行pH敏感的菲克药物释放来展现凝胶化行为。Banerjee和同事们研发出许多基于肽的凝胶因子，并探索了它们的触变行为，药物包埋和释放研究。一种用于顺铂递送的肽两亲系统被研发出来，其中使用了具有MMP-2敏感序列GTAGLIGQRGDS的肽分子。

由于大多数商业抗癌药物是高度疏水的，因此迫切需要设计出可以包埋更高量此类药物的水凝胶。在许多情况下，LMHGs是两亲性的，其中凝胶是由H键和疏水性相互作用两者辅助形成的。尽管由疏水性分子形成的凝胶具有更高的强度，但迄今为止对于它们的生物医学用途探索出来的结果却很少。在凝胶化之前，凝胶因子能否在水中分散均匀影响了超分子的组装和凝胶化。Gao等人第一次尝试使用疏水性相互作用形成水凝胶，其中通过亲水性前体被疏水性分子磷酸酶辅助翻转诱导凝胶化。采用类似的方法，Yang等人研发出了紫杉酚-叶酸衍生物，其通过与基序GpYk偶联，然后通过磷酸酶催化的反应进行自组装。Cheetham等人采用了一种独特的方法，通过使用抗癌药物喜树碱本身的组装形成凝胶结构。

虽然水性凝胶因子-药物共轭物在较慢和受控的药物释放方面表现出明显的优势，但是在共轭期间需要反应性官能团形成可逆键，限制了降低分子数目的药物偶联。此外，共轭总是涉及繁琐的合成程序，其在成本效率和对非专家的可获得性方面也是不成熟的。因此，对于包埋药物，药物分子直接在LMHG水凝胶中的物理包埋仍然是一个健全和流行的方法。在癌症治疗中，物理包埋具有单独包埋大范围的有效载荷分子或特别相关的多种药物组合的优点。

最近，我们报道了从一种L-丙氨酸衍生物（ALA-HYD）中制备的可以包埋并释放多柔比星（一种有效的癌症化疗药物）的可注射水凝胶。当包埋药物的水凝胶被注射到小鼠的肿瘤部位时，可以观察到肿瘤体积显著减小。在1.5％（w / v）的最佳凝胶因子浓度下，所形成的这些基于氢键的水凝胶表现出相当好的机械强度和触变性能。由于抗癌药物的水溶性，疏水性和电荷彼此不同，因此不可能研究出一种可用于各种抗癌药物的通用水凝胶因子体系。据我们所知，尚没有对在给定LMHG中包埋不同抗癌药物的治疗潜力进行系统调查的研究。

因此，为了解决这个问题，我们研究了分别包埋六种不同电荷和疏水性抗癌药物的ALA-HYD水凝胶的包埋功效，药物释放，机械强度，可注射性和抗癌潜力。即多西他赛（DTX），他莫昔芬（TAM），顺铂（CPL），卡铂（CBPL）和5-氟尿嘧啶（5-FU）以及多柔比星（DOX）（图1）。每种药物对癌细胞具有不同的作用模式。DTX通过抑制微管解聚作用而已知其活性；TAM在乳腺组织中作为抗雌激素起作用；铂药物，CPL和CBPL都与DNA结合形成链内交联，从而影响复制；而5-氟尿嘧啶通常是用来抑制核苷酸合成胸苷酸合成酶的。在本文中，我们研究了ALA-HYD凝胶因子对不同尺寸，疏水性和H键结合能力的抗癌药物的包埋效率，释放和特征性抗癌效力。

图1：a)本研究概述了在ALA-HYD水凝胶中包埋药物，同时具有亲水性和疏水性的纤维状网络结构，并且通过扩散进行药物释放；b)本研究中使用的六种不同抗癌药物，多柔比星（DOX），多西他赛（DTX），他莫昔芬（TAM），顺铂（CPL），卡铂（CBPL）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的化学结构

结果与讨论

最初的研究开始于确定1.5％ALA-HYD水凝胶对不同抗癌药物的包埋功效。 将一定量的药物储备溶液加入到热的凝胶因子过饱和水溶液（溶胶）中，并且继续添加直至保持凝胶的完整性。图2是包埋不同药物分子所形成的水凝胶的倒置小瓶图像，其中凝胶因子使溶剂凝胶化的能力随着在凝胶化之前加入到溶液中药物量的增加而降低。每种药物的包埋效果都不同，在这些条件下，包埋量最低的是顺铂（80mu;g），最高的是5-FU（640mu;g）（表格1）。

图2：上述倒置小瓶图像和数字显示了1.5％ALA-HYD水凝胶分别包埋药物DOX，DTX，TAM，5-FU，CPL和CBPL的凝胶化行为和最大包封效率。包封效率表示为每500mu;L的1.5％（w/v）ALA-HYD水凝胶包埋药物的总量（mu;g）。

表格1：ALA-HYD对不同抗癌药物的最大包封效率及其注射性。

对于抗癌药物包埋效果的不同可能是由于非共价的分子间和分子内不同的相互作用，例如药物和凝胶因子之间的氢键，范德华力和pi;-pi;堆积。自组装是使LMHGs在没有化学交联剂的情况下凝胶化的现象。因此，包埋功效的显著差异可能与药物的疏水性程度和分子结构直接相关。5-FU作为最小的一部分并且拥有某种平面结构，它具有最大程度的被包埋能力。酰胺键的存在可能提供氢键水溶性，而氟基团提供弱疏水相互作用。这两种力的平衡以及作为药物，溶剂和凝胶因子之间的另一种可能的分子间相互作用的pi;-pi;堆积导致了凝胶化和高的药物包埋性。此外，由于它的小尺寸，预期5-FU引起凝胶因子组装的扰动最小，即使在高药物负载下也能形成稳定凝胶。

DOX，DTX和TAM抗癌药物之间的包埋性顺序为TAMgt; DOXgt; DTX（图2，表1）; 因为TAM呈现了最大芳族平面结构使其和凝胶因子之间形成芳族相互作用，而DTX本质上是高度疏水性的，其具有最小的pi;-pi;相互作用能力。令人非常惊讶的是，尽管这些药物尺寸小并具有极性，水凝胶对CPL和CBPL的包埋功效却最小，这表明在CPL和CBPL上存在的游离胺基团破坏了存在于高浓度凝胶因子之间的H键。这些分子和ALA-HYD之间缺乏任何芳香相互作用都会进一步减轻它们被包埋在水凝胶中的问题。

我们还同时检查了药物包埋对具有不同抗癌药物的水凝胶可注射性的影响。凝胶的可注射性随着包埋药物浓度的增加按照回归模式而变化，5-FU是个例外，即使在其最大包埋时的凝胶也可以注射。在保持可注射性的前提下，每种药物最多可以掺入80mu;g到凝胶（每500mu;L）中。我们进行了流变学研究，包括药物包埋水凝胶的振幅扫描和频率扫描实验，如图3所示。

图3：流变学研究显示a）频率扫描，b）振幅扫描，c）以80mu;g/500mu;L凝胶体积测定的游离凝胶和载药凝胶的储能模量（G#39;）变化。这些研究指出机械稳定性的凝胶（G#39;gt; Grsquo;rsquo;）和它们不同的强度，作为凝胶和药物相互作用的结果，其强度随药物的包埋而变化。

G#39;（储能模量）和G#39;#39;（损耗模量）值清楚地表明机械稳定的凝胶（G#39;gt; G#39;#39;）的形成。包埋DOX的水凝胶具有最高的机械强度，G#39;值甚至高于原始凝胶，这可能是由于DOX和凝胶因子之间亚胺键的形成。然而，包埋TAM的凝胶在所测试的系统中显示出最低的G#39;，并且几乎是原始凝胶的一半。包埋TAM的凝胶具有较低的机械强度可能是由于药物中叔胺单元的存在干扰了凝胶因子的自组装，导致凝胶强度的显著降低。值得注意的是，凝胶因子的自组装具有足够的弹性以容纳大的疏水性分子如DTX，而其凝胶强度没有显著降低。意料之中的是，凝胶容易容纳5-FU，并且所得的凝胶与原始凝胶强度相当。包埋CBPL的凝胶与包埋CPL的凝胶在机械上相比较不稳定，这是由于CBPL相比CPL的分子较为复杂，以及羧酸盐相对于氯化物配体不能容纳在凝胶因子中。

SEM的研究表明除了包埋CPL的凝胶之外，在水凝胶的纳米级形态中没有很多可察觉到的差异（图4）。包埋CPL的凝胶呈空心棒状结构，而包埋其他药物的凝胶呈长的缠结纤维形态，类似于原始凝胶。凝胶因子包埋的CPL药物中-NH ₂部分更高的氢键能和更高的药物平面性促使其容易掺入到纤维网络内，导致凝胶形态的改变。相反，CBPL的非平面性降低了凝胶-药物的相互作用，并且我们发现在包埋CBPL的凝胶结构中没有可察觉到的变化。

图4：包埋80mu;g不同药物的凝胶的扫描电子显微镜照片。所有的比例尺为200nm，CPL除外，其尺寸为1mu;m。

然后我们在37℃（图5）时生理pH下进行了这些水凝胶的药物释放研究。负载DOX的水凝胶显示出最大和最快的释放，其中80％的药物在96小时内释放，而5-FU水凝胶显示最慢的释放，在96小时内释放约70％的药物。5-FU作为结构上更小的部分，与其他药物（表1）相比最大程度地结合到凝胶中，并且这种缓慢和持续释放模式表明5-FU和凝胶因子之间存在着有利的相互作用和相容性。有趣的是，负载5-FU的凝胶的机械强度也与游离凝胶的机械强度相当。负载DTX和TAM的水凝胶显示出类似的趋势，其48小时后释放60％。然而，我们不能研究负载CPL和CBPL的凝胶的释放规律，因为难以用HPLC检测释放量（因为其低于仪器的检测限制）。这可能是由于药物的-NH ₂基团和凝胶因子之间的强相互作用，导致释放慢得多，这也可以解释为：与其它四种药物相比，它们掺入凝胶结构中的量最少。

图5：分别包埋了80mu;g DOX，DTX，TAM和5-FU的水凝胶在96小时内的累积药物释放曲线，结果显示与所有其他药物相比，DOX释放速率最快，5-FU的释放缓慢且均匀。

凝胶网络提供药物的持续释放，其帮助药物在肿瘤位点保留更长时间，从而在更长的时间段内增加其抗癌效力。持续释放也有助于预防肿瘤的复发。我们研究了包埋药物的水凝胶对鼠乳腺癌4T1细胞系的抗癌潜力。4T1细胞在反式孔板的下部室上培养，并将载药的杂交凝胶浇注在反式孔板上。我们进行了MTT测定，来研究在4T1细胞中存在游离药物以及包埋在凝胶中的药物时的细胞增殖。处于5-FU, CPL 和 CBPL被凝胶包埋和游离状态的环境中的细胞的活性几乎相差一倍。用药物或水凝胶-药物处理细胞的细胞死亡情况比较（图6）表明，与用游离药物处理的那些细胞相比，负载药物的水凝胶对细胞的毒性更小，这进一步证明药物从水凝胶中的控制释放。

图6：对于4T1细胞系，比较游离药物和包埋在水凝胶中的药物的细胞毒性，表明与直接处理细胞的药物相比，包埋在水凝胶中的药物的毒性降低，这是由于药物从凝胶网络中控制释放。平均值plusmn;SD，n= 3。

结论

总之，我们研究了L-丙氨酸衍生的水凝胶因子ALA-HYD物理包埋各种抗癌药物的能力。ALA-HYD可以仅仅通过物理混合而不使用任何共价或偶联来包埋所有具有不同能力的药物。这六种药物在不同负载能力下形成可注射的水凝胶系统，表现出最佳机械强度。这些凝胶-药物系统揭示了纳米-纤维形态和潜力，证明了治疗的适用性。由于CPL和CBPL能够与凝胶分子形成更强的相互作用，从而破坏凝胶因子之间的物理相互作用，CPL和CBPL结合到凝胶网络中的量最少。在37℃下通过扩散过程的药物体外释放在每种情况下表现出所预期的药物缓慢和持续释放，与游离DOX和5-FU相比，细胞存活明显增加。因此，该系统进一步开辟了以几种组合（亲水-亲水或亲水-疏水）的药物双重包埋和测试它们对抗肿瘤效果的可能性。本研究不仅为疏水性药物引入了合适的载体分子，而且增加了在同一凝胶中进一步包埋两种药物的合适组合的范围，从而提高其效率。

实验部分

材料和方法：抗癌药物：多柔比星，多西他赛，他莫昔芬，5-氟尿嘧啶，顺铂和卡铂; 和十二烷基硫酸钠（SDS），Tween-80（购自Sigma Aldrich）。HPLC级甲醇和乙腈（来自Spectrochem）。如前所述合成凝胶因子化合物ALA-HYD。

水凝胶的制备：使用早先报道的方法在水性介质中用1.5％（w / v）的凝胶因子浓度制备水凝胶。通过倒置玻璃小瓶来检查凝胶化。

药物包埋和注射性研究：在它们各自的溶剂中制备药物原料，如亲水性药物即DOX和5-FU溶解在水中，而疏水性药物如TAM和DTX溶解在DM

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