英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

环糊精对牛血清蛋白与十二烷基苯磺酸钠相互作用的影响

摘要：环糊精提供了调节蛋白质与表面活性剂相互作用的可能性。在我们的工作中，采用了等温滴定量热法（ITC）、荧光色谱和圆二色谱法，研究了环糊精（CD）对牛血清蛋白（BSA）和阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（SDBS）相互作用的影响。环糊精能够通过结合BSA和SDBS之间的静电力和疏水基的相互作用，对BSA和SDBS的强烈相互作用产生轻微的阻碍。此外，alpha;-环糊精的效力高于beta;-环糊精，这是因为alpha;-环糊精与表面活性剂的相关常数更低所致。由于环糊精与表面活性剂的疏水相互作用强于BSA与与表面活性剂，因此alpha;-环糊精和beta;-环糊精都对BSA与SDBS的非特异相互作用产生阻碍。

关键词：牛血清蛋白 十二烷基苯磺酸钠 特异相互作用 非特异相互作用 环糊精

1. 前言

蛋白质的生物功能取决于蛋白质的结构，因此，实施了大量的工作，来研究蛋白质的形态-功能的关系。然而，蛋白质的形态-功能关系在本质上不是静止不变的，相反，它对于蛋白质采取非天然或者部分折叠构象来表达特异的功能经常是很有必要的。实际上，表面活性剂经常被用来调节蛋白质的形态和功能。控制蛋白质-表面活性相互作用的能力对于涉及蛋白质-表面活性剂体系是很重要的。环糊精这样的一种分子，它能够通过与表面活性剂成键来实现对蛋白质-表面活性剂相互作用控制。

环糊精是具有环状结构的低聚糖，并且它的相对非极性空腔能够容纳许多种类的分子来形成“包裹”复合物。它们因此提供了破坏蛋白质-表面活性剂相互作用的可能。受此启发，我们探究了环糊精调节蛋白质与表面活性剂相互作用的可能性。除了调控蛋白质与表面活性剂的相互作用，我们的研究还建立了一般的三元函数，包括环糊精、表面活性剂和蛋白质。

尽管这样的体系很重要，但据我们所知，除了人工分子伴侣辅助折叠过程外，在科学论文中再也找不到有关环糊精在调节蛋白质和表面活性剂相互作用上更深入的报道了。在人工分子辅助复性的过程中，由于环糊精与表面活性剂的疏水基相互作用强于蛋白质与表面活性剂，因此，随着环糊精的加入，表面活性剂分子从蛋白质-清洁剂复合物中剥离。在这个过程中，完全存在于蛋白质与表面活性剂之间的特异相互作用没有纳入考虑。

在血浆中，牛血清蛋白是最为丰富的球蛋白，它是一条由583个氨基酸组成单肽链，并且具有相对高的水溶性。牛血清蛋白能够弯曲缠绕成许多不同类型的生物分子，这一点对于决定其生理学功能具有重要的作用。在过去几年中，许多研究者已经探究了牛血清蛋白和离子表面活性剂的相互作用。表面活性剂结合在蛋白质的过程包括两个主要阶段：（1）特异结合阶段，和蛋白质上的离子团最初的结合是由表面活性剂“头部”与蛋白质的离子团的离子间相互作用以及疏水相互作用所致。（2）非特异结合阶段，将表面活性剂的烷基链与蛋白质结合主要依靠协同作用。

在我们之前的工作中，得到了一些有关环糊精对牛血清蛋白和十二烷基硫酸钠相互作用影响的重要结果。为了更好地弄清环糊精对于牛血清蛋白和有苯基的阴离子表面活性剂之间的相互作用，我们系统深入地探究了不同空腔大小的环糊精，对牛血清蛋白和十二烷基苯磺酸钠在特异性结合和非特异性结合阶段的影响。结果发现，有趣的是，和牛血清蛋白-十二烷基硫酸钠体系相比，环糊精对于牛血清蛋白-十二烷基苯磺酸钠在特异结合阶段的相互作用具有不同的影响。我们的结果表明，蛋白质-表面活性剂的相互作用以及环糊精与表面活性剂的复合能力都决定着环糊精对蛋白质-表面活性剂相互作用的影响程度。

2．实验

2.1实验材料

牛血清蛋白（BSA）和十二烷基苯磺酸钠（SDBS）（99%纯度），sigma公司提供，使用前未进一步提纯。十二烷基苯磺酸钠的纯度由悬滴法测得的表面张力值以及微光学接触角（OCA 40, DataPhysics仪器，Filderstadt，德国），表面张力无最小值—观察了SDBS的浓度分布。alpha;-环糊精和beta;-环糊精均从Aldrich公司购置，使用前未进一步纯化，所有的样品均事先保存在pH=6.8、浓度为5.0 mmol·dm^minus;3的磷酸钠缓冲溶液中。牛血清蛋白的浓度保持为0.01 mmol·dm^minus;3，其余所使用的试剂均为分析纯，由上海化学试剂公司提供，溶剂采用超纯微孔滤膜水。

2.2微量热的测定

滴定热由微量热公司的VP-ITC滴定微量热仪测量，北爱普顿，MA，在298K下，采用标准器具规格采用的250-mu;L的注射器和1.438 cm³的样品池。每次注射间隔为10s，每一次连续注射后的预平衡时间为240s。样品池在搅拌器中以307r/min的速度旋转，以保证样品能够充分混合。原始数据从加热速率-时间图中得到。然后，对这些原始数据进行整合，以每摩尔注射的SDBS和CD的焓变(Delta;Hobs, kJ·mol^minus;1)对SDBS的浓度(mmol·dm^minus;3)或C_CD/C_SDBS作图。整合热脉冲数据，校正混合热和稀释热，通过非线性回归来分析标准平衡下的结合模型，采用Microcal Origin软件来得到平衡结合常数的估计值和络合物形成过程的焓。所有的实验过程至少重复两遍，保证再现性是在plusmn;2%以内。

ITC数据由Origin软件自动收集。通过减去基热来对注射热进行修正，以便进行更深入的分析。利用Origin软件中的VP-ITC系统自带的非线性最小二乘法（马夸特法）对数据进行拟合。所有的数据和单一位点结合模型中提供的结合常数（K），结合焓（Delta;H）很好的拟合。其中K和Delta;H的值用来进行进行结合过程中Gibbs自由能的变化(Delta;G°)和熵变(Delta;S°)，采用如下公式：Delta;G°=minus;RTlnK,Delta;S°=Delta;H°minus;Delta;S°。

2.3 稳态荧光光谱的测定

稳态荧光光谱实验采用配备恒温循环水槽的RF-5301冷光分光仪（日本岛津公司），在实验过程中，对于BSA溶液，激发和发射的狭缝宽度分别是3.0和1.5nm。激发波长设定为295nm，发射波长的范围从300-500nm。

2.4 圆二色谱的测定

圆二色谱的测定在298K的条件下，采用1.0cm的石英比色皿，由IASCO-810分光光度仪记录。扫描范围在190nm-360nm之间，每个取样点的间隔为0.5nm，采集时间为0.5s，特别地，为了提高信噪比，采用了对3个光谱取平均值的方法。为了使得到的光谱更平滑，勾选了厂家提供的软件中的降噪选项。

3.结果与讨论

3.1．环糊精对牛血清蛋白和十二烷基苯磺酸钠相互作用的影响

荧光色谱和圆二色谱的结果均表明环糊精添加到0.01mmol·dm^minus;3的牛血清蛋白水溶液的量（超过11mmol·dm^minus;3）均不会对牛血清蛋白的结构造成影响。这表明环糊精和牛血清蛋白之间没有相互作用，这和之前的结果一致。因此，环糊精对牛血清蛋白和十二烷基硫酸钠之间相互作用主要由表面活性剂和环糊精的相互作用引起。

图一.298K下SDBS溶液滴入到0.01mmol·dm^minus;3BSA溶液（●），环糊精溶液（▲），BSA/环糊精混合溶液中（■）的ITC曲线。注射器中SDBS浓度为1.0mmol·dm^minus;3，(C_BSA = 0.01 mmol·dmminus;3, C_CD = 0.5 mmol·dm^minus;3), beta;-CD (A), alpha;-CD (B) (1 kcal·mol^minus;1 = 4.184 kJ·mol^minus;1)

表一.298K下SDBS结合到BSA低亲和和高亲和结合位点的热力学数据

3.1.1．环糊精参与下牛血清蛋白和十二烷基苯磺酸钠的相互作用

等温滴定量热法是研究生物大分子之间结合性能的一个重要工具，图一中A和B分别表示1.0mmol·dm^minus;3的SDBS溶液滴入BSA溶液，环糊精溶液，BSA/环糊精混合溶液中的ITC曲线。如图一，在环糊精的参与下，SDBS与BSA的结合会放出热量，并且两种结合位点有着明显的转变。当SDBS的浓度在0.05mmol·dm^minus;3（C′）以下时，SDBS分子通过疏水相互作用和静电相互作用特异性结合到蛋白质高亲和位点上。高于C′后，这些高亲和位点已经完全饱和，在低亲和特异性结合位点上继续结合。伴随在结合过程中的热力学参数从ITC曲线上得出，并通过除去稀释效应来进行校正，列于表一中。我们的结果和前人的研究结果一致。在结合过程中，焓和熵均对Gibbs自由能有较大的贡献。对于alpha;和beta;-环糊精，SDBS滴入BSA/环糊精混合溶液和单独滴入BSA溶液的Delta;H_obs出现了偏差，这表明，在0.5mmol·dm^minus;3的alpha;或beta;-环糊精的作用下，SDBS与BSA的特异性结合在某种程度上受到了阻碍。此外，beta;-环糊精对两条曲线造成的偏差更大，因此，beta;-环糊精在调节SDBS与BSA之间的特异性结合上比alpha;-环糊精更为有效。

图二.（A）在无环糊精（■），alpha;-环糊精（●），beta;-环糊精（▲） F/F₀对SDBS浓度作图，插图显示的是低浓度下F/F₀对SDBS浓度作图.(B) SDBS溶液滴入到0.01mmol·dm^minus;3BSA溶液（■），BSA/alpha;-环糊精混合溶液（●），BSA/beta;-环糊精混合溶液（▲）ITC曲线(C_BSA = 0.01 mmol·dmminus;3, C_CD = 0.5 mmol·dm^minus;3,1kcal·mol^minus;1 = 4.184 kJ·mol^minus;1)

表二.环糊精对SDBS与BSA结合时的C′和C1（mmol·dm^minus;3）的影响（CBSA=0.01 mmol·dm^minus;3）

从图1中同样可以得到，环糊精的参与会导致C′的缺失。因此，荧光色谱测试被用来深入研究环糊精参与下SDBS与BSA的相互作用，它能够清楚的提供C′的值。在295nm波长激发的荧光色谱能够用来监测BSA由于与表面活性剂相互作用而导致的三级结构的变化。这些相互作用能够导致色氨酸残基周围的微环境的变化，因此在BSA的荧光色谱中会显示出来。本征荧光色谱分析能够区分在295nm的波长激发下色氨酸残基的微环境的变化，因此提供了一种记录蛋白质构象和结构变化的有用工具。图二展示的0.01 mmol·dm^minus;3BSA在有无环糊精参与下F/F₀对C_SDBS作图，F和F₀分别代表有无SDBS 存在下 BSA 的荧光发射强度，在没有环糊精的参与下，C′转变点可以很清楚的从图2A中得到，这和ITC实验结果一致。由于SDBS中较高苯环浓度会对BSA的荧光色谱造成影响，因此本实验中SDBS的浓度小于0.4 mmol·dm^minus;3，所以无法从荧光色谱结果中得到C₁和C₂的值。在有无环糊精的参与下从图2A中得到的C′转变点列于表2中。在alpha;-环糊精和beta;-环糊精的作用下，C′分别从0.052增加到0.095 和0.078 mmol·dm^minus;3。当环糊精的浓度增至0.5 mmol·dm^minus;3，C′的增加相对较小，这表明alpha;-环糊精和beta;-环糊精的添加只能在某种程度上减弱SDBS与BSA 的高亲和特异性结合。很明显，beta;-环糊精能够更有效地阻碍SDBS与BSA的高亲和特定相互作用。

表3.环糊精对Kq的影响（CBSA=0.01 mmol·dm^minus;3）

从图2A中同样可以得到

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[148930]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word