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遭受热胁迫的水稻叶片中的光系统Ⅱ光化学，光抑制，与叶黄素循环

Yan Yin, Shumei Li, Weiqin Liao, Qingtao Lu, Xiaogang Wen, Congming Lu

摘要：为了研究强光如何影响光合作用对热胁迫的反应，以及在光系统II（PSII）上的黑暗或光照（1000mu; mol m^-2s^-1）中遭受高温（25-42.5°C）的影响，我们在水稻植物中研究了光化学和叶黄素循环。在高于35摄氏度的温度下，二氧化碳同化率下降，有光照的下降幅度大于黑暗的。PSII光化学（F v / F m）的最大效率在黑暗中没有显示出明显的变化，但是显示在有光的情况下显著降低。 此外，非光化学淬灭（NPQ）有所增加，而光照中的增加比在黑暗中更大。此外，在有光照情况下，叶黄素循环的脱环氧化状态随温度升高而显著增强。与对照叶相比，喷洒二硫苏糖醇的叶子F v / F m降低的幅度更大，但在高于35℃的温度下，叶黄素循环的NPQ和脱环氧化状态的增加非常小。另一方面，抗坏血酸来源的叶子显示F v / F m的降低幅度较小，但NPQ和叶黄素循环的脱环氧化状态的增加幅度很大。叶片和叶绿体中的抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性在光照情况下比在黑暗中增强的幅度大。在黑暗中，热胁迫对叶片和叶绿体中抗坏血酸和谷胱甘肽的含量没有显著影响，但是，在光照条件下，档温度高于35℃时，会导致叶片和叶绿体中的抗坏血酸和谷胱甘肽含量降低。我们的研究结果表明叶黄素循环通过增加叶绿体中的抗坏血酸盐池来保护PSII免受热诱导的光抑制起着重要作用。

引言：

热胁迫是限制植物生长和生产力的主要环境因素(Berry and Bjouml;rkman, 1980; Lobell and Asner, 2003）。在植物的生理过程中，光合作用是热胁迫最敏感的过程之一，抑制发生在温度仅略高于生长最优的温度（Allakhverdiev et al.，2008; Yamamoto et al.，2008）。虽然许多研究已经研究了光合作用对热胁迫的反应，但是在热胁迫下抑制光合作用的机制仍不清楚（Allakhverdiev et al.，2008; Yamamoto et al.，2008）。一个提出的抑制机制是由于热诱导的活化酶活性降低，热胁迫抑制核酮糖二磷酸（RuBP）羧化率，它调节了Rubisco激活状态（Salvucci and Crafts-Brandner，2004; Kurek et al.，2007）。另一个提出的机制是热胁迫抑制光合电子传递，并且在热胁迫下Rubisco激活状态的降低是由其他限制（包括电子传输）导致的调节响应（Cen and Sage, 2005; Makino and Sage, 2007）。此外，光系统II（PSII）长期以来被认为是光合作用装置中对热量最敏感的组分（Berry and Bjouml;rkman,1980;Havaux,1996）。然而，最近的研究表明，热胁迫不会引起严重的PSII损伤，而是抑制PSII的修复（Sharkey，2005; Allakhverdiev et al.，2008）。

应该指出，大多数关于热胁迫对光合作用的影响的研究已经在黑暗中进行（Allakhverdiev

et al., 2008; Yamamoto et al., 2008）。在自然条件下，特别是在夏季的白天，温度通常升高到30-40℃，光强可以达到1000-2000mu; mol m^-2s^-1，光和热应力叠加（Yamamoto et al.，2008）。实际上，在这样的条件下观察到通过高光对光合成的增强的热损伤（Al-Khatib and Paulsen，1989; Ohira et al.，2005）。然而，高光条件下的热胁迫如何影响PSII光化学和多余光的耗散是未知的。

米是世界上最重要的谷物之一，主要生长在热带和亚热带地区。即使在温带地区全球变暖也可能会增加水稻产量的不稳定性（Horie et al.，1996）。据报道，高温可能对水稻产量产生有害影响（Peng et al.，2004）。因此，关于高温对光合作用的生理影响的研究应具有重要意义，是不可或缺的。在这项研究中，我们调查了在黑暗和高光条件下，热胁迫对水稻植物CO 2同化，Rubisco活化状态，PSII光化学和叶黄素循环的影响。我们的研究结果表明，虽然热诱导的光吸收加剧了高光，但是叶黄素循环通过增加氯塑料中的抗坏血酸盐池来增强，以保护光合器官免受进一步的损害。

材料和方法

植物材料和生长条件

水稻（Oryza sativa，L.cv.9311）植物在自然阳光条件下，相对湿度为70-80％的25plusmn;1℃的温室中生长。中午的最大辐照度为约1000mu; mol m^-2s^-1。 植物在带有塑料幼苗（25cmtimes;20cmtimes;10cm）的浇水土壤中生长，土壤为含壤有机物质为2.6％的砂壤土，可用的N-P-K分别为112,36.2和87.9mgkg -1。 每个塑料幼苗箱包含大约40个水稻植物。

热胁迫治疗

生长后1个月对稻秧进行各种实验。 为了研究热胁迫对光合生理和生物化学参数的影响，将整株植物在黑暗中暴露于各种温度（25-42.5℃）1小时。另外，为了研究高光对光合作用对热胁迫反应的作用，在光照为1000mu; mol m^-2s^-1下对整株植物进行热处理。对于分离叶片的热处理，将叶片（约2cm ²）直接放入黄铜块的一个小孔（5.5cm高times;3cm直径）的光滑底部，其中温度通过循环水从恒温水浴调节。同时，通过一块玻璃直接压制叶盘的上表面，从而可以防止叶子的水分蒸发，同时可以立即达到叶片与黄铜块之间的热平衡。将叶片在高光照（1000mu; mol m^-2s^-1）下暴露于不同的高温下20分钟。所有的生理和生物化学参数的测量都是在最幼小的完全扩张的叶上进行的。

气体交换分析

使用开放系统（Ciras-1，PP systems，UK）在完全扩展的水稻幼苗叶上进行净光合气体交换的测量。暴露于不同高温1小时后，将整株植物温度恢复至25℃，然后分析气体交换。光饱和光合速率在二氧化碳浓度360mu;ll^-1，温度25℃，相对湿度80％，饱和光（1200mu; mol m^-2s^-1）下进行。

Rubisco的光依赖性激活的测定

为了测定Rubisco的光依赖性活化，在25℃下，将饱和光照1200（1200mu; mol m^-2s^-1）对整株植株照射10分钟，以促进Rubisco在1h高温处理后的充分活化。照明后，立即收集叶组织以确定初始和总数Rubisco活动。Rubisco的光依赖性活化的测定主要根据Feller等 （1998）。Rubisco（Perchorowicz et al.，1981）的激活状态被计算为初始与总Rubisco活动的相对比例。

叶绿素荧光测定

在叶片暗适应10分钟后，用便携式荧光计（PAM-2000，Walz，Germany）在室温下测量叶绿素荧光。 这个实验遵循Genty等人（1989）的实验方案。通过测量调制光测量所有PSII反应中心打开的最小荧光水平（F o），这种最小荧光足够低（lt;0.1mu; mol m^-2s^-1），不诱导任何显著的可变荧光。所有PSII反应中心关闭的最大荧光水平（F m）通过在暗适应叶中以8000mu; mol m^-2s^-1的0.8s饱和脉冲测定。然后，用白色光化光（1000mu; mol m^-2s^-1）连续照亮叶片。约5分钟后，记录荧光的稳态值（F s），并施加8000mu; mol m^-2s^-1的第二饱和脉冲，以确定光适应状态（F mrsquo;）中的最大荧光水平。去除光化光，并通过用3s脉冲的远红光照射叶来确定光适应状态（F o lsquo;）中的最小荧光水平。F o和F orsquo;的所有测量都用测量光束设置为600Hz的频率进行，而F m和F mrsquo;的所有测量均用测量光束在饱和闪光期间自动切换到20kHz。使用光和荧光参数，我们计算：（1）黑暗适应状态下PSII光化学的最大效率，（2）光化学淬灭 系数，，（3）非光化学淬灭，（vanKooten and Snel，1990），（4）光适应状态下的实际PSII效率（Genty et al.，1989）。 荧光命名法根据van Kooten和Snel（1990）。

抗坏血酸谷胱甘肽循环中所涉及的酶的活性的测定

抗氧化酶测定主要根据Jiang和Zhang（2001）进行。可溶性蛋白质在含有1mM EDTA和1％聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的10ml的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中提取，在抗坏血酸过氧化物酶测定的情况下加入1mM抗坏血酸。将匀浆在4℃下以15,000times;g离心30分钟，并将上清液用于以下酶测定。通过监测290nm处吸光度的降低（消光系数2.8mM^-1cm^-1）来测量抗坏血酸过氧化物酶（APX，EC1.11.1.11）的活性，并通过H₂O₂对抗坏血酸的降低，来对非酶氧化进行校正 （Nakano and Asada，1981）。在340mm（消光系数为6.2mM^-1cm^-1）的NADPH氧化后测定谷胱甘肽还原酶（GR，EC1.6.4.2）活性，并在无NADPH情况下对340nM的背景吸光度进行校正（Schaedle and Bassham， 1977）。通过监测由于形成抗坏血酸而在265nm处的吸光度增加（消光系数14mM^-1cm^-1）来测量脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR，EC1.8.5.1）活性，并且对非酶促还原反应（脱氢抗坏血酸通过还原型谷胱甘肽）的速率进行校正（Hossain et al Asada，1984）。在NADPH的氧化中（Arrigoni et al.，1981），通过观察340nm处的吸光度（消光系数2.8mM^-1cm^-1）的降低来测量单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR，EC1.6.5.4）活性。

抗坏血酸和谷胱甘肽的测定

ASC（降低抗坏血酸）含量标准根据Arakawa等 （1981）。总谷胱甘肽通过根据Griffiths（1980）的酶循环测定方法测定。通过2-乙烯基吡啶衍生物去除GSH（还原型谷胱甘肽）后测定GSSG（氧化型谷胱甘肽）。通过从总谷胱甘肽含量中减去GSSG来确定GSH。

叶绿体的分离

根据Mullet和Chua（1983）的方案，以Per-coll密度梯度离心分离完整的叶绿体。 通过测量渗透压休克前后的铁氰化物光还原测定了完整叶绿体的百分比。在本研究中，完整叶绿体的百分比约为85％。

抗坏血酸和二硫苏糖醇喷洒

叶片在叶柄上用刀片在水下切除以栓塞。 将分离的叶子放入1ml 10mM抗坏血酸或5mM二硫苏糖醇或水（对照）中，并在黑暗中在25℃下培养2小时。

颜料和蛋白质分析

取叶样，立即在液氮中冷冻。 将叶样品在冰冷的100％丙酮中萃取，并将颜料提取物通过0.45mu;m膜过滤器过滤。如Thayer和Bjouml;rkman（1990）所述基本上通过HPLC分离和定量颜料。蛋白质含量根据Bradford（1976）的方法测定。

结果

Rubisco的CO ₂同化和Rubisco活化酶介导的激活

图1A显示了高温对水稻幼苗CO₂同化的影响。 当温度高于35℃时，二氧化碳同化率在黑暗和光照下都明显下降。 然而，二氧化碳同化率的下降在光照中比在黑暗中更大。 这些结果表明在光照下进行高温处理时，CO₂同化对高温的敏感性明显提高。由于已经报道Rubisco活化酶对高温非常敏感，并且在高温条件下限制光合作用起着重要作用（Feller等，1998; Salvucci and Crafts-Brandner，2004），我们研究了高温对 Rubisco活化酶在黑暗和光照下的活性。在本研究中，我们观察到无论是在黑暗中还是在光（数据未显示）中完全氨基甲酰化的Rubisco的活性（即总Rubisco活性）在25和42.5℃之间的温度范围内不受影响。另一方面，最初的Rubisco活性在黑暗和光照下随着温度的升高而明显降低，表明高温导致Rubisco活化状态的显著降低。图1B显示了在黑暗和光线下高温对Rubisco激活状态的影响。 高温导致Rubisco激活在黑暗中或光照中逐渐抑制。 然而，在黑暗和光线下观察到Rubisco激活状态没有显着差异。 这些结果表明，光照中高温诱导的二氧化碳同化作用比黑暗中更强的降低与Rubisco激活无关。

图1 热胁迫对CO 2同化速率（A）和Rubisco激活状态的影响程度计算为水稻植物初始与总Rubisc

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