一种环境抗生素的分析检测方法的建立开题报告
2020-02-18 19:31:26
1. 研究目的与意义（文献综述）
1研究意义及现状
1.1目的和意义
水环境中药物活性组分主要来源于城市生活污水、动物养殖场废水、医院污水、制药厂废水等近年来，由于人类对抗生素的过分使用甚至滥用，在水体、沉积物、土壤等各种环境介质中不断检测出抗生素的残留，抗生素成为环境中重要的新型污染物。虽然这些化合物的暴露浓度通常相对较低但由于其本身具有较强的持久性、生物反应活性及难生物降解性等特点[1]，因此可以对人类和水生、陆生生物产生长期性的潜在危害。更为严重的是，这些低浓度抗生素药物相当一部分不能被人体或动物直接代谢或转化，而是通过尿液和粪便的排泄进入到生活污水，对细菌微生物能够产生持久性的选择性压力，使其逐渐具有抗药性特征，这类抗药性菌群的快速演变和散播，将会对人类和其它生物的健康和安全造成难以预计的威胁，因此环境中抗生素的污染问题引起了各国学者的广泛关注污水处理厂是阻止抗生素进入环境的最后屏障但是[2]，传统的污水处理厂处理工艺主要是消除或减少常规的污染物，如cod、bod、氮磷等营养物质，并没有特别针对抗生素的去除工序，因此不能完全去除污水中残留的微量抗生素类污染物许多研究表明污水处理厂出水的排放是水环境中抗生素的一个重要来源。因此，研究抗生素在城市污水处理过程中的行为和归趋，能更好地评价其对抗生素的去除效果，同时可促进城市污水中抗生素类药物的减量化技术的开发[3]。
2. 研究的基本内容与方案
2研究内容
2.1研究任务
通过查阅了大量文献，选取 5 种典型抗生素( 包括喹诺酮类、大环内酯类和磺胺类抗生素) 作为研究分析对象，调查汤逊湖污水污水处理厂中的浓度水平、环境行为和归趋，同时检测分析其在脱水污泥样中的含量水平。最后，利用质量平衡分析和潜在风险分析进一步探讨典型抗生素的潜在去除机制。该研究旨在掌握抗生素在污水处理工艺中的去除规律和分布行为，为评价其潜在的危害性提供科学依据，同时为揭示环境中抗生素的来源以及将来的工艺改造提供理论基础和技术支持。
2.2研究方案
本次研究主要过程为准备工作、样品采集、分析方法的建立、质量平衡分析、潜在风险风险评估和结论。
标准品阿奇霉素(azithromycin，AZM)、红霉素(erythromycin，EＲY)、罗红霉素(roxithromycin，ＲOX)均购自美国Sigma-Aldrich公司;莫西沙星(moxifloxacin，MOX)购自欧洲EuropeanPharmacope公司;诺氟沙星(norfloxacin，NOＲ)购自德国Dr．Ehrenstorfer公司;内标物标准品西玛通(simetone，SMT)、咖啡因-13C(caffeine-13C3，CF-13C)分别购自美国Accustandard与美国Sigma-Aldrich公司。甲醇、甲酸、醋酸铵均为色谱纯(Merck公司);水为超纯水(Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司)。固相萃取柱(OasisHLB，500mg/6mL)购自Waters公司。1μm玻璃纤维滤纸与0.45μm尼龙滤膜分别购自Whatman和Millipore公司。所有药品都是优级纯(＞90%)。
标准储备液和标准工作液的配制:分别称取25.00mg标准品，用甲醇溶解并定容于50mL棕色容量瓶中，配制成500mg·L－1的标准储备液，于－20℃下保存．脱水红霉素溶液(EＲY-H2O)由EＲY标准溶液制备:向EＲY标准溶液中加入适量3mol·L－1的硫酸调节pH至3.0，室温下振荡4h，用质谱仪检测残留的红霉素及其代谢产物来验证反应的完全性，然后用稀NaOH溶液调节pH至6.0，定容，于4℃下保存。实验时，根据需要配制各种浓度的工作标准溶液，于4℃下保存。
2.2.2样品采集
2019年3月～5月期间，每隔一周采一次样，共计4次，每次取两个平行样。根据污水处理流程，按污水厂水力停留时间采集进水和消毒出水，每个样品采集量为500mL，加入适量NaN3(0.5g·L－1)以抑制微生物作用。样品采集后装在棕色玻璃瓶中，冷藏运回实验室进行测定。同时采集脱水污泥样品，采样方式为12h内，每3h采集1次的混合样(每次采集的量相等)，污泥样品用锡箔纸包裹，冷冻干燥后保存于－20℃冰柜中备用。
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2.2.3分析方法的建立：
2.2.3.1分析方法的选择
2.2.3.1.1前处理方法
常用的前处理方法是固相萃取法，其具有灵敏度高、操作便捷，不易受到交叉污染等优点。根据目标化合物类别的不同，采用适宜的SPE柱和相应的淋洗液，即可实现目标物的富集。
喹诺酮类：可采用C18、SDB等，pH值条件为4.0-4.5.但由于SDB是阳离子交换柱，易受水中金属离子的影响，不适用于高硬度水。对于河湖等天然水体中奎诺酮类的测定，更适合采用C18柱。可用的SPE柱有：ENV 柱、C18柱、LC-18，Oasis柱等；阳离子交换柱有：SDB、MPC等。pH值条件从2-10都有报道。SPE柱有单独使用吸附柱或离子交换柱，也有将二者串联后使用。
2.2.3.1.2检测方法：
1、高压液相色谱-荧光法测定（HPLC/FD）：2001年Golet用HPLC/FD检测城市污水中的环丙沙星和氧氟沙星 ,其检测限分别是0.45 mg/kg·dw和0.18 mg/kg·dw。
2、超高压液相色谱LC-MS/MS串联：LC-MS/MS串联可同时实现10余种，甚至数十种不同类抗生素的测定。灵敏度高，选择性和解析性好，并有一定的基体抑制作用。磺胺类、四环素类、大内环酯类、喹诺酮类、β-内酰胺类等都适用此方法。此外还有毛细管电泳、免疫测定技术等方法。
3、 高压液相色谱-紫外检测(HPLC/UV)：Turiel等建立了利用HPLC/UV技术检测湖水和河水中9 种喹诺酮类抗生素的方法,检测限分别8 ～ 15 ng/L和8 ～ 20 ng/L。
4、气相色谱-质谱联用：Sacher 等使用GC － MS 检测水中咔吧咪嗪、布洛芬、氯贝酸、双氯芬酸等多种药物的测定，但这一方法主要应用于易挥发、热稳定的化合物检测。且测定抗生素时需要先将其衍生化，比较繁琐。还会因抗生素官能团的性质和数量上的差异导致建立方法困难。
综上所述，检测抗生素的分析方法比较理想的方法是固相萃取 LC-MS/MS方法。不仅能实现便捷准确的定性定量检测，更重要的是能抗生素的含量、分布和迁移变化等的普查中发挥很好的作用。HPLC/UV和HPLC/FD法对特定种类的抗生素也有较好的检测效果。由于抗生素在全世界范围内普遍使用，其在环境中的滞留和作用情况应引起足够的关注。
2.2.3.2分析方法的建立
本次实验采用液质联用(LC-MC)来分析水样中典型的抗生素，液质联用不需要像单纯色谱分离那样需要达到一定的分离度才能进行准确的定性及定量分析，在液相色谱质谱联用中，目标化合物在液相色谱柱中的分离只是粗分离，进入质谱后，由一级质谱选择母离子，将其打碎，再由二级质谱选择碎片离子，从而进行定性定量，这样既能有效防止样品中复杂基质的干扰，从而降低检出限，又能节省大量时间。
2.2.3.2.1水样前处理
准确量取500 mL水样，用甲酸和氨水调节至pH=7，过0.45 μm滤膜。在不干柱情况下，将水样以不大于10 mL/min的速度通过HLB ( 3 mL, 60 mg , Waters )和WCX( 3 mL ,60 mg ,Waters)串联小柱(事先经6 mL甲醇、6 mL水活化)进行富集，6 mL纯水淋洗净化，在65 kPa的负压下抽干20 min，用6 mL甲醇分三次将目标化合物洗脱，室温下氮气吹至近干，1 mL甲醇定容，过0.22 μm的有机相和水相滤膜到进样瓶中，待测。
2.2.3.2.2污泥样前处理
将沉积物充分混匀，制成薄饼于铝箔纸中，在冷冻干燥器中冷冻干燥24 h。将干燥后的沉积物研磨，并过80目筛。称取5 g(精确至0.01 g)过筛沉积物于50mL离心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙睛(V/V)涡旋混匀3 min，超声提取20min,5000 r/min离心5 min，将上层清液转移到离心管中，重复萃取一次，合并清液于40℃旋转蒸发浓缩至近干，1 mL甲醇定容，过0.22 μm的有机相和水相滤膜到进样瓶中，待测。
2.2.3.2.3质谱方法的建立
质谱采用电喷雾离子源（ESI）正离子模式进行检测，监测模式为选择反应性监测模式（SRM）。具体参数如下：喷射电压为4500V;鞘气压力8Arb;为辅助气压力25 Arb；离子传输管温度为350℃；源内碰撞诱导解离电压（CID）10V。
2.2.3.2.4液相色谱条件的确定
流动相为含0.1%甲酸的甲醇溶液(A)和0.1%甲酸水溶液(B)，色谱分离为梯度洗脱:0~1.5 min, 10% A; 1.5~7 min, 10%A~90%A; 7~8.5 min, 90%A; 8.5~1.5min, 90% A~10 %A; 13.5 ~25 min, 10% A;流速为0.2 mL/min;进样量为10微升
2.2.3.2.5标准曲线的建立
用甲醇将1 μg/mL抗生素混标稀释成7个不同浓度的标准使用液(1, 2, 5, 10, 20,50, 100, 250 ng/mL )，上机检测并绘制标准曲线。
2.2.3.2.6加标回收率与精密度试验
取空白水样500 mL，加标浓度分别为10, 100和200 ng/L，每个浓度3个平行。称取20g(精确至0.01 g)空白沉积物样品溶于1 OOmL含有抗生素混标的甲醇中，使其浓度分别为5和50 ng/g，置于阴凉处风干。每个浓度3个平行。
2.2.4质量平衡分析
每种典型抗生素的平均质量流量通过下列方程式计算:
M污水=Q×c污水×10-6
M污泥=P×c污泥×10-6
式中M污水、M污泥分别为抗生素在污水相和污泥相的质量流量，g#8226;d-1;c污水、c污泥分别为在污水和污泥中测得的抗生素浓度，ng#8226;L-1、ng#8226;g－1;Q、P分别为污水流速和污泥产率,m3#8226;d-1、Kg#8226;d-1。
典型抗生素在污泥处理过程中的总体去除效率计算式为：
R总=c进水×Q-c进水×Q c污泥×Qc进水×Q
水相去除率为：
R水%=c进水×Q c出水×Qc进水×Q×100
式中c进水、c出水、c污泥分别为测定的进水（ng#8226;L-1）出水(ng#8226;L-1)、污泥(ng#8226;g－1)中抗生素浓度。
每种抗生素的人均日质量负荷Li通过下列公式计算：
Li=c进水×Q服务人口数
2.2.5潜在风险分析
质量平衡分析中算得汤逊湖污水处理厂出水中目标潜在风险分析抗生素的总日质量负荷，由此得出抗生素的负。但抗生素类物质使用量大、频率高、处理率低,致使其源源不断地输入到环境水体中,造成“假持久性”现象。残留抗生素低浓度、长周期的暴露给生物体和生态环境带来的潜在风险不容忽视。
采用风险熵(riskquotient,RQ)评价法去评价受纳水体中抗生素的环境风险。RQ的计算方法为检测环境浓度(measuredenvironmentalconcentration,MEC)与预测无效应浓度(predictednoeffectconcentration,PNEC)的比值。当RQlt;0。1时,表明存在较低风险;当0。1lt;RQlt;1时,表明存在中度风险;当RQgt;1时,表明存在高度风险,需要采取相应的风险消减措施。各目标抗生素的PNEC可参照文献获得,根据风险评价中“最坏情况”原则,使用最大检出浓度计算污水厂出水中各抗生素的RQ值。
3. 研究计划与安排
| 周次 | 时间（周） | 毕业论文内容 |
| 5 | 1 | 完成开题报告 |
| 6、7、8 | 4 | 水样采集 |
| 9 | 1 | 准备试剂 |
| 10 | 1 | 标准液的配制 |
| 11 | 1 | 水样分析 |
| 12 | 1 | 数据整理与分析 |
| 13、14 | 2 | 论文书写 |
| 15 | 1 | 论文改进 |
| 16 | 1 | 参加论文 |
4. 参考文献（12篇以上）
参考文献
[1]徐维海，张干，邹世春，等．典型抗生素类药物在城市污水处理厂中的含量水平及其行为特.［j］．环境科学，200728(8):1779-1783．
[2]甘秀梅，严清，高旭，张怡昕.典型抗生素在中国西南地区某污水处理厂中的行为和归趋.［j］.环境科学,2014,35(5).
