摘 要

本文主要研究了一株戈登氏菌CR5S的生长特征，最适生长条件，最适培养基代谢产物提取和代谢产物特征。通过实验确定CR5S的最适培养条件为：温度30℃、接种量5%、摇床转速100rpm、pH=7.0；最适培养基为：碳源替换为2.5%参麦 1%蔗糖的PR培养基；生长曲线四个阶段时间为：0-10h停滞期，10-48h对数期，48h-64h稳定期，72h内未见到明显的衰落期。碳源对其生长的影响为：参麦效果最好，蔗糖、麦冬、水苏糖和葡萄糖次之，其他碳源均不理想，如果加入1%蔗糖，所有碳源效果均有明显提升。测试细胞的红外光谱，对细胞碎片中提取的色素进行全波长和三维荧光扫描，发现其中含有包括β-胡萝卜素在内的多种类胡萝卜素。

本文对CR5S菌株的生长特性和产物特征有了初步了解，并探索了分析色素的方法，有助于对此类菌株的更进一步研究。

关键词：戈登氏菌；发酵；生长特性；类胡萝卜素；代谢产物

Abstract

In this paper, the growth characteristics of a strain of Gordonia CR5S, the optimal growth conditions, the optimum medium metabolite extraction and metabolite characteristics were studied. The optimal culture conditions for CR5S were determined by experiments: temperature 30 ° C, inoculum volume 5%, shaker rotation speed 100 rpm, pH=7.0; optimal medium: PR culture with carbon source replaced by 2.5% ginseng 1% sucrose The four stages of growth curve are: 0-10h stagnation period, 10-48h log phase, 48h-64h stable period.No obvious decline period was observed within 72h. The effect of carbon source on its growth is: the best effect of ginseng, sucrose, Ophiopogon japonicus, stachyose and glucose, and other carbon sources are not ideal. If 1% sucrose is added, the effect of all carbon sources is obviously improved. The infrared spectrum of the cells was tested, and the pigment extracted from the cell debris was subjected to full-wavelength and three-dimensional fluorescence scanning, and it was found to contain various carotenoids including β-carotene.

In this paper, we have a preliminary understanding of the growth characteristics and product characteristics of CR5S strain, and explored the method of analyzing pigments, which is helpful for further research on such strains.

Key Words：Gordonia; fermentation; growth characteristics; carotenoids; metabolites

目 录

第1章 绪论 3

1.1 戈登氏菌 3

1.2 类胡萝卜素 3

1.3合成类胡萝卜素的途径 4

1.4 相关研究进展 5

第2章 材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 菌种 8

2.1.2 培养基 8

2.1.3 试剂 8

2.1.4 实验仪器 9

2.1.5 实验设备 9

2.2 降解菌CR5S的生长特性研究 9

2.2.1 实验目标 9

2.2.2 实验方案 10

2.3降解菌CR5S生长条件的单因素实验 10

2.3.1 实验目标 10

2.3.2 实验方案 10

2.4 改变碳源对CR5S生长的影响 12

2.4.1 实验目标 12

2.4.2 实验方案 12

2.4.3 碳源优化组合实验 12

2.5 CR5S菌体的红外光谱 12

2.6 色素提取液的全波长扫描光谱 13

2.7 色素提取液的三维荧光光谱 13

第3章 数据处理 14

3.1 生长曲线 14

3.2 单因素实验 15

3.2.1 培养温度因素 15

3.2.2 接种量因素 16

3.2.3 pH因素 16

3.2.4 溶解氧量因素 17

3.3 改变碳源对CR5S生长的影响 17

3.4 色素提取液的全波长扫描光谱 19

3.5 色素提取液的全波长扫描光谱 19

3.6 色素提取液的三维荧光光谱 20

第四章 结论 22

第五章 展望 23

参考文献 24

致谢 25

第1章 绪论

1.1 戈登氏菌

戈登氏菌属于放线菌目、棒杆菌亚目、戈登菌科、戈登菌属，1971年由Tsukamura发现，将其命名为Gordona bronchialis^[1]，后于1997正式命名为Gordonia。

戈登式菌属于好氧菌，革兰氏阳性，G C含量在64%-69%之间。

戈登式菌具有比较简易的细胞形态，呈短杆状，没有孢子丝。其分布广泛，分布于人体和各种自然环境中，如Tsukamura就是从人呼吸道中分离得到的戈登氏菌，而污水、油井、土壤中也存在戈登式菌。存在一些类型的戈登氏菌，能够降解大分子化合物如天然橡胶和芳香烃类化合物，有益于物质循环和能量的多级利用^[2]。

戈登氏菌发酵产类胡萝卜素的产量比酵母高，是一类优秀的类胡萝卜素产生菌，并且对于碳源和氮源的要求不高^[3-6]。需要注意的是，戈登氏菌也是一类条件致病菌，能够引发多种人类疾病，如呼吸道类疾病，因此实验操作中需要避免感染。

1.2 类胡萝卜素

类胡萝卜素是一类普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类的天然色素，呈黄色、红色或赤橘色。

类胡萝卜素的结构一般含40个C。可分为以下3类：

（1）胡萝卜素。是一类羟基化合物,能够溶于石油醚、丙酮等有机溶剂，基本都含有碳氢键，其中比较常见的是蕃茄红素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素。

（2）叶黄素。叶黄素别称胡萝卜醇, 包含含氧基团如呋喃基、羟基等，是一类胡萝卜素的非酸性氧衍生物。比较多的有叶黄素、虾青素、新黄质等。

（3）类胡萝卜素酸。含有羧基，能够在碱性溶剂中溶解。比较常见的有：藏花素、胭脂树橙和红酵母红素等。

类胡萝卜素的不饱和度一般比较高，是高度不饱和的多烯,这说明其含有很多共轭双键，同时存在较多的甲基支链。类胡萝卜素的色彩深浅与共轭双键的数量有关，共轭双键越多，色素的色彩越加红移。

类胡萝卜素在工业上通常被用作食物和脂肪的着色剂,如番茄红素、玉米黄质、叶黄素、辣椒红、藏花素等一系列食用或非食用添加剂，用途广泛。

长期以来对于β胡萝卜素的研究较多，它们是人体内维生素A的重要来源，是良好的淬灭剂，具有抗癌、抗氧化、抗辐射、抗衰老的功效^{[7, 8]}。目前世界上有近2亿儿童患有维生素A缺乏症，而一些种类的类胡萝卜素（如β胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素）的摄入能有效补充维生素A。维生素 A具有脂溶性，一般无色。β-胡萝卜素存在于动物体内，只需加两分子的水，就可以断裂成为两个视黄醇(即维生素A)。维生素A存在于动物肝脏,血液和眼球的视网膜中，只有在黑暗全反式视黄醛转变成为11顺视黄醛才气与视卵白连系构成视紫红质，而紫红质与视觉的发生进程有关，故缺维生素A会致使夜盲症。类胡萝卜素被广泛应用于医药、食品和化妆品行业，可用于食品添加剂，人们已经大规模地使用其制造人造黄油、干酪和蛋黄酱等食品。

动物和人不能通过自身合成类胡萝卜素，主要是从食物中摄取。一些蔬菜（胡萝卜、油菜、西兰花、西红柿等）中富含胡萝卜素，叶黄素主要来源于水果和禽类蛋中（芒果、柑橘、杏、蛋黄等）。而在人体内，类胡萝卜素主要分布于脂肪、血液、视网膜黄斑、黄体等组织中，缺少类胡萝卜素，特别是对于老年人，严重的有可能导致视力衰退。

类胡萝卜素有着明显的皮肤保护、抗氧化功能，大量的动物和人体实验表明了这一点。同时，它对于心血管疾病和骨质疏松症也有着一定的预防作用，如柑橘中的β-隐黄质能促进健康人的骨形成、抑制骨吸收，降低风湿性关节炎的发病几率。

在一定范围内，类胡萝卜素切实表现出抗癌功能，合理摄入高含量类胡萝卜素的生果蔬菜能降低癌症发病率。如Holick和Michaud发现叶黄素对肺癌的发作有着迟滞作用^[9]。但同时并不是大量摄入类胡萝卜素就一定能减少癌症发生的可能，有研究表明过量的β-胡萝卜素摄入不但不能保护人体，还有可能增加肺癌发病的几率。

1.3合成类胡萝卜素的途径

首要是经由化学过程法、植物提取法取得类胡萝卜素。少部分是由微生物发酵出产。

自然产品提取的类胡萝卜素具备极高的生物活性，但是产地、原料和获得难易度等缘由注定了其没法大规模出产；微生物发酵法因对于环境条件没有依赖性，产生的β-胡萝卜素安全、无毒，被认为是对人体无害的天然食品添加剂^[10]，其具有发酵条件简略、无毒无害、出产周期短、成本低的优点，受到研究者存眷。

迄今已发现有光合细菌，霉菌，酵母和藻类Ⅻ作为首要的产类胡萝卜素的菌株。其中的光合细菌需要光照条件的支持，不适合在发酵罐中大规模培养；运用较普遍的霉菌如三孢布拉霉菌，具有生物量高、生长迅速的优点，是优良的选育菌株，在国际上被广泛应用，但技术工艺较为复杂。三胞布拉霉菌发酵产类胡萝卜素的工艺过程中存在一系列的工艺难题，如培养液粘度高、溶解氧操作难等，在我国，距大规模工业化出产还存在一段不小的距离。

操纵光合细菌出产类胡萝卜素，固然如今色素发酵程度比三孢布拉霉菌低，但也具备前文说起诸多长处：成本低廉，可轻易操纵发酵，有利于工业化出产，而且可以操纵蔗糖、废糖蜜等培育，原料简易便于获得。

菌种的生长受pH、温度、水分、碳源、接种浓度等一系列条件的影响，因此需要得到最适培养条件以提高菌群的生长速度。

为了进一步提高产量，必要对其培养基进行研究，在不同培养基中对照其代谢产物的差别，采用其中产量较高培养基。在此培养基基础上，筛选最适宜的氮源、碳源，筛选出对发酵有重要影响的无机盐类，以期获得适宜的培养基配方^[11-13]。

微生物合成的类胡萝卜素产物性质和比例主要由培养条件决定。类胡萝卜素的生物合成模式与类萜的合成模式同样。

类胡萝卜素衍生物经由缩合连接，八氢番茄红素由两个单元缩合成。自然界中的高等植物、藻类和真菌都能将八氢番茄红素脱氢,顺次产生番茄红素等物质。其合成类胡萝卜素的途径可以被描述为三步^[14]：

（1）乙酰辅酶A被HMG-COA合酶催化，转化为3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-COA），再转化为含C₆的化合物甲羟戊酸（MVA），经由MVA激酶磷酸化、脱羧等反应而转变为异戊二烯基焦磷酸（IPP）。

（2）IPP与另外三个IPP分子异构化，产生的二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）在异戊烯基转移酶的催化下得到C₂₀化合物香叶基焦磷酸（GGPP），GGPP自身缩合，生成八氢番茄红素，经过脱氢反应，得到番茄红素。

（3）在番茄红素异构化进程当中，番茄红素作为前体，经由一系列反应，构成环状结构的类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、γ、胡萝卜素、红酵母烯、虾青素等。

如红酵母合成β-胡萝卜素的途径是通过环化酶催化番茄红素，将其末端环化为β、γ或ε环，再由CrtYB基因编码的环化酶催化，经过环化反应，得到β-胡萝卜素^[15]。

虽然已经有研究说明环化类胡萝卜素的前置产物是番茄红素或链孢红素，不过人们还没有彻底了解类胡萝卜素环化进程。叶黄素这类含氧的类胡萝卜素是经由直接引入氧分子而合成的。番茄红素作为重要的前置产物，在产类胡萝卜素微生物发酵过程中或多或少都会产生，提取鉴定的过程中需要注意。

1.4 相关研究进展

出产胡萝卜素的影响因素中，光照被认为是重要的一个条件。从本质上来说，微生物在光照下合成类胡萝卜素的过程就是避免自身结构被光能量损伤的行为，属于光保护机制，因此对于白光敏感。Moline等^[16]研究在红酵母菌中类胡萝卜素对细胞抗光性的影响，发现红酵母红素的存在提升了菌株在紫外光下的存活率。有无光照的前提下，β胡萝卜素的产量有明显不同，光照条件下β-胡萝卜素的产量提升67.4%，这也表明了光照条件对于发酵进程的影响。

碳源和氮源的影响也很重要，何^[11]等对一株戈登氏菌（gordonia sp.）产类胡萝卜素的培养基进行探究，得出最适碳源为蔗糖，最适氮源为KNO₃的结论。且MgSO₄、FeSO₄作为金属离子的助剂加入能显著影响产量，在最适培养基条件下，类胡萝卜素产量可达到600.5mg/L，相较于初始培养基提高了212.5%。

此外，温度、通气量等因素也关系到生产类胡萝卜素的产量。温度会影响细胞的发展代谢进程，转变类胡萝卜素的合成路径，影响各类酶促进程，从而对产量有着影响。通气量影响的是发酵过程中氧的供给，生物量的增长速度取决于基质的同化速率，同时影响生物合成，如Saenge等^[17]的研究中，通气速率从0vvm增加到2vvm时，生物量和脂质产量有显著提升，达到峰值。

可以经由选育菌株和发酵条件优化，增高出产效率，增添某些发酵助剂如硫胺素、金属离子、番茄汁等可以明显增产。如杨^[18]等在发酵过程中分别加入K 、Mg 和NH⁴ 作为助剂，发现对数期提前了2-4h，并且产量得到了大幅提升。翟^[19]等利用响应面法探索维生素的加入对发酵的影响，当添加维生素B₁=0.2mg/L、维生素B₂=1.0mg/L、维生素C=0.7mg/L时，类胡萝卜素产量12.35mg/L，比未添加时产量提升近10个百分点。

本课题的研究目的是对一株戈登氏菌CR5S的生长特征进行探究，寻找最适培养基，评估碳源对培养效果的影响，并研究代谢产物的特性，确定产物种类。

主要的技术路线如下：

图1 技术路线

Fig.1. Technical route

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

菌种CR5S为武汉理工大学资源与环境工程学院微生物实验室冷藏菌种，是一株戈登式菌，经三次固体培养活化。

2.1.2 培养基

PR培养基（1L）配方：蔗糖25g，鱼粉蛋白胨3g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸氢二钠1.5g，磷酸氢二铵0.4g，磷酸二氢钾0.7g，硫酸镁0.2g，酵母浸膏0.1%，硫酸锌0.01g。固体培养基另加2%琼脂。

2.1.3 试剂

表2.1 试剂名称、纯度及生产厂家

Table 2.1 Reagent name, purity and manufacturer

2.1.4 实验仪器

分析天平

PH计