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Al³ 引发谷胱甘肽封端的铜纳米团簇的聚集诱导效应及其作为肌酐的荧光探针的应用研究

摘要：提出了一种显示聚集性诱导发射（AIE）的谷胱甘肽包覆的铜纳米簇(Cu NCs)。利用这一特点，对肌酐（CRN）进行了选择性、灵敏性的定量检测，CRN是一个重要的诊断指标。在AI³ 离子存在下，这些Cu NCs迅速聚集，从而导致红光发射增强。通过透射电镜和荧光分析证实了Cu NCs的AIE性质。加入CRN后，CRN与AI³ 离子的配位作用减弱了AIE，导致荧光猝灭。在激发/发射峰为360/585 nm处测得最佳荧光强度。荧光淬灭强度与CRN浓度在2.5—34 mu;g L^minus;1范围内呈线性关系，检出限为0.63 mu;g L^minus;1。 讨论了探针用于CRN检测的传感机理。将该探针用于人血清样品中CRN的测定，结果令人满意。

关键词：荧光纳米材料 荧光法 金属纳米簇 纳米传感器 纳米探针 配对t检验 肾生物标志物 实际样本分析 血清分析

传统的发光团的聚集通常会导致聚集猝灭(ACQ)，其中聚集的发光团会导致高浓度的发光猝灭。ACQ效应一直是生物传感器发展的一大障碍。2001年，唐的团队发现了一种新的聚集诱导发射光物理现象（AIE），其中发光剂 (AIEgens)在良好的溶剂中一般表现为无或弱发射，而在聚集态或固态^[1]中则表现为高频发射。有趣的是AIE的特性可以将发光剂的荧光量子产率(QY)提高两个数量级^[2]。与传统的发光体不同，它具有合成简单、易改性、分子结构可变可调、稳定性好、成膜能力强、聚集态发射效率高等优点。因此，它们有可能应用于各种高科技领域，如光电子器件、荧光传感器和生物成像等^[2-4]。

荧光金属纳米簇(Fluorescent metal nanoclusters, NCs)是一类新型的荧光团簇，由数个到数百个金属原子组成，受到了广泛的关注^[5,6]。金属纳米簇具有超小尺寸、低细胞毒性、特异的金属核配体壳结构和良好的光物理性质等吸引人的特性，在化学和生物传感应用中显示出巨大潜力^[5,7,8]。然而，纳米簇的量子产率仍然远远低于半导体量子点和碳点^[9-11]。AIE现象首先出现在非平面有机分子中。然而，研究表明，一些金属纳米簇(NCs)，如硫化铜纳米簇也具有这种特殊的AIE特性，被认为是显著提高金属纳米簇的荧光量子产率的建设性方法^{[2,12 - 14]}。此外，金属纳米簇与发光剂相比，主要优点是金属纳米簇的红/近红外发射，避免了生物基质自身荧光的干扰，有利于其在生物成像和生物传感领域的应用。溶剂和阳离子诱导的AIE均被报道用于金属纳米簇。例如唐等人。通过固态发光和由溶剂引发的聚集而导致的发光的强烈增加，验证了银纳米簇的AIE发射效应。此外，他们还使用铝离子诱导聚集法来测定无机焦磷酸酶活性^[15]。苏等人制备了具有AIE特征的L-半胱氨酸覆盖的铜纳米簇，使Cu NCs作为pH调控反应的功能材料^[16]。

肌酐是一种代谢废物分子，由人体肌肉代谢自然产生。它通常由肾小球滤出，并在尿中释放，而不被肾小管吸收。体液(血液和尿液)中肌酐水平异常意味着肾功能活动的下降^[17,18]。因此，CRN是作为肾功能障碍的首选指标，因此开发廉价、可靠、准确的方法来监测体液中^[19]的CRN具有重要意义。由于对CRN的精确定量要求很高，许多研究如毛细血管电泳^[20]、同位素稀释质谱法^[21]、电化学方法^[22,23]、高效液相色谱法测光^[24,25]、荧光^[26],比色法^[27]以及生物传感器^[28]均进行了CRN的检测。

1. 实验

1.1 材料和设备

荧光强度和光谱采用岛律RF-5301PC荧光光谱仪(日本，https://www.shimadzu.com)，配备石英比色皿(1 cmtimes;1 cm)。激发单色仪和发射单色仪的狭缝宽度均设置为5 nm。紫外-可见吸收光谱采用日本京都岛津UV2550分光光度计记录。所有光学测量均在室温下进行。透射电镜(TEM)图像是由蔡司(Leo 906, and Germany, https://www.zeiss.com/y/int/home.html)拍摄的。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)是从样品的KBr颗粒在Tensol -27 FT-IR光谱仪(Bruker 公司,德国,https://www.bruker.com)上记录的。

所有化学品都至少是分析级的，并按规定使用。双蒸馏去离子水，由Ghazi血清公司提供（伊朗，http://sgco infication）。在整个实验过程中使用的氢氧化钠、L-半胱氨酸、尿素、丙氨酸、硫酸铜、蔗糖、葡萄糖、乳糖(CuSO·5H₂O)和硝酸铝(Al(NO₃)₃· 9H₂O)均取自默克公司(德国，http://www.merckmillipore.com)。CRN和还原型GSH从Sigma-Aldrich公司(https://www.sigmaaldrich.com)购买。

1.2 制备Cu NCs

所述的一步法合成Cu NCs。详情载于电子补充资料(ESM)。

1.3 阳离子诱导AIE

为了评估不同的阳离子对AIE的触发能力，在制备的300 mu;L的Cu NCs和200 mu;L Tris-HCl缓冲液（pH=7.0，0.1 M）中加入300 mu;L的0.50 mm金属阳离子 （K ,Na ,Ca2 ,Zn² ,Mn² ,Mg² ,Ba² ,Ni² ,Co² ,Cd² ,Fe² ,Cu² ,Fe³ ,Ce³ ），用去离子水稀释至3.0 mL。培养5 min后，在最佳发射波长和激发波长下监测荧光光谱。

1.4 荧光法检测程序

在4.0 mL标准比色皿中，分别加入300 mu;L Cu NCs、200 mu;L Tris-HCl缓冲液（pH=7，0.01 M）和300 mu;L Al³ （400 mu;M）溶液，用去离子水稀释至2.5 mL，在室温下平衡5 min，然后加入适量的CRN标准溶液。之后，用去离子水将体积达到3.5 mu;L，再培养6 min。最后，使用360 nm、585 nm的激发波长记录荧光强度。

1.5 实际样品分析

人类健康血清样本由输血中心(伊朗大不里士)提供，冷冻(- 20℃)保存，加热至室温2小时后使用。通过向血清中加入不同浓度的CNR，使血清样本中CRN的浓度最终达到0.1和0.6 mg L^minus;1。然后，在分析之前，将每一份血清样品（含或不含CRN峰）的200 mu;L小份用水稀释至50 mL，但未进行任何特殊处理。样品是安娜在B荧光检测条件下进行分析。根据校准曲线方程计算未知浓度（见分析性能部分）。回收率(%)的计算方法为定量的CRN含量与添加样品的CRN含量之比。在相同条件下重复实验3次，得到相对标准偏差(RSD)。通过与完全独立标准比色法的比较，验证了该方法的实用性。(详见《电子补充材料》)。

1. 结果和讨论

2.1 材料的选择

GSH是一种天然三肽，由三个氨基酸组成，具有一个氨基和两个羧基。GSH是制备Cu NCs的还原剂、保护剂和封端剂。与牛血清白蛋白和溶菌酶等蛋白质相比，谷胱甘肽是一种更强的还原剂^[29]。选择GSH作为Cu NCs的保护配体的另一个重要考虑因素是，GSH能够与铝离子配位，从而触发Cu NCs中的银离子的排放。 此外，作为制备Cu NCs的前驱体，Ag NCs和Au NCs具有产量丰富、廉价和易于从商业来源中获得等优点，近年来受到了越来越多的关注。因此，Cu NCs比贵金属纳米簇有更好的应用前景。

2.2 Cu NCs的合成与特征

GSH修饰的Cu NCs是根据先前提到的一锅法^[12]制备的。它不仅可以作为Cu NCs制备过程中的还原剂和封端剂，而且可以与引发Cu NCs聚集诱导发射的铝离子协同作用。Cu NCs的紫外-可见吸收光谱（图1a）表明，Cu NCs在240-300 nm范围内有微弱的吸收峰，但在585 nm附近没有发现明显的吸收带，这表明Cu NCs的纳米团簇大小和分子性质以及缺乏更大的吸收峰铜纳米粒子^[3]。

在360 nm处激发后，Cu NCs溶液在585 nm处出现弱荧光峰（图1b）。 以罗丹明6G（0.95乙醇溶液）为荧光标准，测定了Cu NCs的荧光量子产率为3%。 如图1b所示，通过施加不同的激发波长，Cu NCs的发光几乎是恒定的；这种与激发无关的FL行为表明Cu NCs相对单分散，为分析应用提供了独特的优势。 如TEM图像所示（图1c），Cu NCs的形貌呈球形，具有良好的单分散性。Cu NCs的尺寸分布直方图也如图（图1d）所示。表明Cu NCs的尺寸分布在1-4 nm的窄范围内，平均粒径为2.4plusmn;0.4 nm。 用FT-IR（图S3）（电子辅助材料）对Cu NCs表面的表面基团进行了验证。1400~1550 cm^-1处的强峰和3400 cm^-1处的宽峰分别归因于N-H弯曲和O-H拉伸振动。羰基的特征吸收峰出现在1700 cm^-1左右。红外光谱中与-COOH和NH₂基团有关的吸收带的存在证实了GSH的保护性配体的存在。此外，2550 cm^-1处-SH拉伸振动特征峰的消失证明了GSH与Cu NCs之间形成共价键（Cu-S-R）（图S4）。

图1. CuNCs的紫外-可见光谱，CuNCs在330~380 nm不同激发波长下的b荧光光谱，CuNCs的透射电镜图像，CuNCs的d粒径分布直方图

2.3 Cu NCs的AIE特性

Cu NCs在环境光下呈黄色透明，在紫外光照射下几乎不发光。在1.1 mg L^-1 Al³ 存在下，测定了Cu NCs的荧光量子产率（QY）为27%。这种令人印象深刻的发射增强可以在365 nm处的紫外光下看到（图2a）。

我们使用有机溶剂来确定Cu NCs的聚集诱导发射特性。如图S5和图S6所示,分散在水和有机溶剂（DMSO或etha-nol）混合溶剂中的Cu NCs的荧光强度随着有机溶剂的体积分数（溶剂极性的降低）的增加而大大增强，这是由于GSH在Cu NCs表面的极性很高。这种增强归因于AIE现象，这与以前的报告一致^[13，15]。

此外，还研究了几种常见的阳离子对Cu NCs发光的影响。如图S7所示，Cd² 、Al³ 和Ce³ 的存在使Cu NCs的发光增强，其他的作用不明显或影响较小。铝离子表现出较强的增强能力。铝离子对GHS配体的亲和力最大，通过配位反应^[15]使Cu NCs有效聚集。

图2a. 添加1.1 mg L^minus;1 Al³ 的Cu NCs（1）之前和（2）之后的荧光光谱Cu NCs（插图：左侧照片用于日光下的Cu NCs，右侧照片用于紫外线灯下添加1.1 mg L^minus;1 Al³ 的Cu NCs）。

在pH= 7和培养6 min后获得荧光光谱和右照片，以及Cu NCs聚集体的TEM图像（在4 ml稀释的Cu NCs上添加1.1 mg L^-1 Al³ ）

通过添加浓度为0.027~1.1 mg L^-1的铝离子，Cu NCs的荧光强度持续升高，在1.1 mg L^-1的浓度下达到平台期（图S8）。这种现象是由于Cu NCs在铝存在下的AIE特性所造成的，因为刚性聚集结构通过无辐射途径降低能量损失，重新限制分子内振动，从而大大提高发射效率^[30]。

TEM图像（图2b）清楚地说明了添加1.1 mg L^-1 Al³ 后Cu NCs聚集体的形成。这些聚集体具有无定形结构，由许多Cu NCs组成。

2.4 分析性能

Al³ 触发的Cu NCs聚集对CRN有反应。当Cu NCs聚

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