环丙沙星对废水生物脱氮除磷效果的影响

摘要：本研究通过短期和长期实验评估了环丙沙星（0.2和2 mg.L^-1）对活性污泥去除废水养分的影响情况。结果显示在两种浓度下的环丙沙星对活性污泥的表面完整性和活性没有急性不利影响。在短期内两种浓度下，环丙沙星对于活性污泥去除废水营养物的影响可以忽略不计。然而，长期接触环丙沙星使活性污泥去除总磷和总氮的去除效率分别从96.8，95.8％（对照）降低至91.7,84.9％（0.2mg·L^-1）和90.5％，80.2％（2 mg·L^-1），研究表明环丙沙星会抑制活性污泥中的微生物的反硝化作用和磷吸收过程。同时，本研究发现环丙沙星会影响细胞内聚羟基链烷酸酯和糖原的转化。此外，环丙沙星的存在还可导致亚硝酸还原酶和多磷酸激酶的活性受到抑制。通过高通量测序进一步分析发现，与对照组相比，环丙沙星暴露反应器中，以聚磷酸盐为营养物质的生物体的丰度、糖原累积生物体的反硝化细菌减少，这与反应器中脱氮性能的降低趋势是一致的。

关键词：环丙沙星；氮和磷的去除；硝化；反硝化；聚磷酸盐积聚生物体

图形概要

1.介绍

抗生素是一种广泛用于人类和动物疾病预防和控制的药物（Kumar等，2012）。它们通过喂食，注射和药物服给动物和人类。 由于其在抑菌方面的高效率，抗生素在很大程度上被滥用。在过去的几年里，越来越多的抗生素如诺氟沙星，磺胺甲恶唑，萘啶酮酸和甲氧苄啶已在废水、河水和地下水中检出，它们的浓度通常为纳克，微克或甚至毫克每升（Kim等，2015;Dalmaacute;zio等，2007; Ayscough等人，2000）。最近，由于抗生素对藻类和细菌的低浓度毒性很高，并且可能引起自然界细菌群体的抗性，因此抗生素被列为优先风险（Hermando et al，2006）。 发生环境中的抗生素导致抗生素耐药性上升对致病菌。 因此，其对人类细菌及其抗生素抗性基因的人口动态的影响废水和河水在过去几年引起了很多关注（Huang等，2017）。

环丙沙星（CIP）是一种广谱氟喹诺酮类药物用于人类和兽医药物。 它通常被利用用于治疗咽喉炎，鼻窦炎，耳鼻喉等疾病以及气道疾病，如肺炎和支气管炎（Coutu等，2013）。据记载，过去五年里环丙沙星的口服消费量增加了30％（Batt等，2007）。由于CIP的滥用和新陈代谢特征，它一直在废水中越来越多地被发现（Li等，2011）。CIP进入废水的三个主要来源是工业，医院和家庭。 据报道，城市废水中的CIP水平一般在100〜300 ng·L^-1范围内，而医院废水中的CIP水平在21mu;g·L^-1左右（Doorslaer et al。，2014）。然而，CIP生产设施排放的废水CIP浓度可达到4.9 mg·L^-1（Babićet al。，2013）。根据我们对12个污水处理厂（污水处理厂）的调查，位于中国中部的医院或CIP附近生产设施，进水中的CIP浓度在该范围内为0.01-0.3 mg·L^-1。

CIP可影响革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV，从而防止DNA复制并导致细胞死亡。以前的调查表明，假单胞菌属，棒状杆菌属，和微球菌属对抗生素的毒性作用敏感。作为CIP进入水生环境之前的最后一道障碍，污水处理厂被操纵故意培养一系列微生物，如硝化细菌，反硝化细菌，和聚磷酸盐积聚。CIP的存在也可能给这些工程微生物带来毒性，从而恶化了污水处理厂的性能。 冈萨雷斯 - 马丁内斯等人。 报道，350 ng L^-1的CIP诱导了侧流废水处理的部分亚硝化过程的恶化。 但是，迄今为止，还没有报道CIP对主流废水氮和磷去除的潜在毒性。

因此，这项工作的目的是充分评估CIP对废水氮和磷去除的潜在毒性。为了获得更多信息，CIP的城市污水相关水平（0.2 mg·L^-1）和CIP的生产设施废水相关水平（2 mg·L^-1）在这项工作中进行了测试。首先，对CIP对生物脱氮除磷的短期和长期影响进行了研究。然后，通过分析CIP完整性的变化，探讨CIP如何影响生物氮和磷酸化酶的去除活性污泥表面，代谢中间物的转化，关键酶的活性和微生物群落。据我们所知，这是第一项全面评估CIP对污水处理过程的潜在毒性的研究，并且这里得到的发现使工程师们更加关注这些新出现的污染物如CIP对废水生物的毒性治疗过程。

2.材料和方法

2.1亲代反应堆的运行

连续操作工作容积为36L的亲代序批式反应器， 种子污泥从中国长沙城市污水处理厂的二级沉淀池中获得。种子污泥中的CIP含量处于不可检测的水平。 反应器保持在21plusmn;1℃并运行，每天3个周期。每个循环由1.5小时厌氧阶段，2.0小时有氧阶段和2.5小时缺氧阶段组成，随后1小时沉降，20分钟滗析和40分钟空闲阶段。在厌氧阶段的前5分钟，将具有如下所述组成的21L合成废水泵入反应器。搅拌器用于混合沉淀，倾析和空闲阶段。 在好氧阶段，空气以35 L·min^-1的流量通入空气。 污泥停留时间和水力停留时间主要分别在12 d和11 h左右。通过加入2M HCl或2M NaOH将流入液pH调节至7.4。运行约50 d后，在该母体反应器中达到稳定运行，然后取出污泥进行下列毒性试验。化学需氧量（COD），铵的浓度（NH4 -N）和可溶性磷（SOP）浓度分别控制在300,30和10 mg·L^-1左右，合成废水的详细组成如下（mg·L^-1）：384.6 醋酸钇，14.62KH2PO4和49.03K2HPO4·3H2O，114.4NH4Cl，5mg CaCl2,10mg MgSO4·7H2O和0.5mL微量元素溶液组成。微量金属溶液由（g·L^-1）：1.50 FeCl3·6H2O, 0.06 Na₂MoO₄··2H₂O, 0.03 CuSO₄·5H₂O, 0.12 MnCl₂·4H₂O, 0.15 CoCl2·6H2O, 0.12 ZnSO4·7H2O, 0.15 H3BO3, 0.18 KI和10乙二胺四乙酸（Wang等人，2008）。

2.2急性和慢性暴露于CIP

对于急性试验，实验在3个重复反应器中实施，每个工作体积为3L。在缺氧阶段结束时从母体反应器中取出总共9L的活性污泥混合物，并均等分成三个反应器。沉淀和倾析2L上清液后，反应器I和II接收含0.2mg·L^-1和2mg·L^-1 CIP的废水，而反应器III接收不含CIP的废水并设为对照。 除CIP水平外，合成废水的其他组成和浓度与母体反应器相同。所有的操作条件也与母反应堆相同。铵态氮（NH4 _N），亚硝态氮（NO2 - N），硝态氮（NO3 - N），聚羟基链烷酸酯（PHA），糖原，污泥活力和LDH释放（细胞膜损伤标志物）在一个周期内每30分钟测量一次。

对于慢性实验，上述所有反应器都不断运行，以分析CIP可能的慢性影响。 三座反应堆的运行条件分别与急性试验相同。每天记录P，NH4 _N，NO2 - N，NO3 - N的出水浓度。 暴露60天后，所有反应者都达到稳态运行，然后进行转化NH₄ _N，P，NO₂ - N，NO₃ - N，PHA，糖原，污泥活力，LDH释放以及与生物脱氮除磷有关的关键酶（即氨氧化酶（AMO），亚硝酸盐氧化酶 还原酶（NOR），硝酸还原酶（NAR），亚硝酸还原酶（NIR），多聚磷酸酶激酶（PPX）和多磷酸激酶（PPK））。此外，通过高通量测序还探索了CIP对细菌群落结构的影响。

2.3分析方法

按照标准方法（APHA，1998）进行NH4-N，NO2-N，NO3-N，SOP，混合液体悬浮物（MLSS）和混合液体挥发性悬浮物（MLVSS）的测定。根据方法通过气相色谱法分析细胞内PHA，包括聚3-羟基丁酸酯（PHB），聚3-羟基戊酸酯（PHV）和聚3-羟基-2-甲基戊酸酯（PH2MV） 如前所述（Chen等，2015）。总PHA计算为测量的PHB，PHV和PH2MV的总和。 根据文献报道的方法（Pijuan et al。，2010），用高效液相色谱法（Agilent 1200，USA）检测糖原，程序见补充材料。

AMO，NOR，NIR，PPX和PPK活动的分析被完成作为参考（Louvet et al。，2010）。 根据制造商的说明，使用细胞毒性检测试剂盒（LDH释放分析）（罗氏分子生物化学试剂）和细胞计数试剂盒-8（细胞增殖分析（Dojindo））分别测量活性污泥的LDH释放和细胞活力。

根据参考文献（Mino等，1998）通过PCR和高通量测序测定细菌群落结构。 长期实验后，使用PowerSoilreg;160 DNA分离试剂盒（MOBIO，San Diego，CA USA）根据制造商的说明从提取的污泥中提取DNA。通过XP Cycler（Bioer，中国上海）使用通用引物338F（5ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）对16S rRNA基因进行PCR扩增。以10mu;L的基因组DNA（5ng /mu;L），3mu;L的各引物（1mu;M），3mu;L的DMSO，25mu;L的Phusion高保真PCR进行PCR扩增，总体积为50mu;L 与HFBuffer（NEB，伊普斯维奇，马萨诸塞州美国）和无核酸酶的水混合（至50mu;L）。所有样品在扩增测定中一式三份以减少可能的PCR错误。 将三种平行样品的PCR产物与Agencourt AMPure XP 60ml试剂盒（Beckman Coulter，CA USA）混合并纯化，并使用NanoDrop分光光度计（NanoDrop-1000，Thermo Scientific，USA）。然后将纯化的样品在最后的步骤中以相同的质量浓度汇集在一起，将其用于文库构建。高通量测序由Miseq（Illumina，San Diego，CA USA）使用上海古合信息公司的配对末端测序（2times;300bp）方法实施。

2.4统计分析

所有测量一式三份进行，结果以平均值plusmn;标准差表示。 使用方差分析来评估结果的显着性，并且p ＜0.05被认为是统计学显着的。

3.结果与讨论

3.1 CIP对生物脱氮除磷的急性和慢性影响

实验结果表明，流出物氮的循环变化（NH4 -N，NO2--N或NO3 - N）和磷（SOP），CIP暴露反应器几乎与对照组相同（图S1），表明0.2和2 mg·L-1 CIP的存在对从废水中去除生物营养物没有急剧影响。 然而，长期暴露于CIP后氮和磷的去除效率都会降低。如表1所示，平均总磷（TP）和总氮（TN）去除对照组的效率分别为96.8％和95.8％左右。长期接触0.2 mg·L^-1 CIP可降低TP的去除率，TN去除率达到91.7plusmn;0.6％和90.5plusmn;1.4％。 当活性污泥暴露于2 mg·L^-1 CIP时，TP和TN的去除率分别降至84.9plusmn;1.3％和80.2plusmn;1.4％。结果表明虽然短期暴露CIP没有对废水养分去除的不利影响，长期暴露磷和总氮的去除效率显着降低。 在下文中，将探讨CIP如何影响生物硝基和除磷的细节。

3.2 CIP如何影响氮和磷的去除？

尽管CIP的突然存在对生物营养物去除没有显着影响，如上所述，但仅在暴露3天后显着降低了氮和磷的去除（图.1）。观察到这种不利影响持续在整个操作中（图S1）。为了获得更多的信息，图2显示了稳定运行后SOP，NH ₄ minus; N, NO^minus;₃-N, and NO^minus;₂-N 的循环变化。可以看出，磷酸盐释放过程不受影响，但是CIP的存在抑制了磷酸盐摄取过程。随着CIP从0增加到2 mg·L^-1，出水SOP浓度增加从0.29 mg·L^-1增加到1.58 mg·L^{-1 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料}

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