藻类的研究

----短小芽孢杆菌中微绿球藻物种的生长抑制研究

史葛.富布赖特、史蒂芬. 奇泽姆、肯尼思. 里尔顿

摘要

由于害虫对藻类生产力的严重影响，所以对大型藻类进行持续的培养是一大挑战。为了优化藻类生产力，了解藻类养殖生态将需要在虫害管理实践有重大进步。迄今为止，关于影响商业相关藻类菌株的细菌性有害生物了解十分有限。本研究，从200升工业藻类生长系统中和表现不佳的南绿藻培养物中分离出细菌。为了确定生长抑制菌是否在其中发挥了作用，将分离的细菌重新接种到实验室规模的南绿锥菌培养物中。其中一株为B.pumilus可对藻类生长产生抑制作用，该作用取决于细菌生长条件。结果表明，B.pumilus培养滤液具有抑制南绿球藻的能力，说明该菌中释放出一个活性分子。并且不影响杂草藻类小球藻和四纹小球藻的生长。因此，B.pumilus显著改变了双藻培养物中的藻类种类组成，从而使杂草藻类在培养过程中占据主导地位。这是第一次报道一种对商业上重要的南诺氯菌属的培育产生重大负面影响的细菌。

关键词：栽培生态学、菌藻的相互作用、芽孢杆菌、微绿球藻

1.导言

具有较高产油率的藻类菌株与适合大规模生产藻类的其他性状相结合，可称为“精英”菌株。大量资源被用于发现、筛选和基因操纵精英藻类，以优化含油量和其他性状。商业上的藻类操作通常是为了在开阔的管道或封闭的光生物反应器中培养高密度的精英菌株[1]。然而，在开放和封闭系统中，微生物如杂草藻类、捕食者、真菌、细菌和病毒等有机体可能进入培养过程。这些有机体构成复杂的、可变的群落，可以影响藻类的生产力[2] ，这对不断增长的强大的、大规模的“精英”文化构成了重大挑战。藻类种植者的一个逐渐展现的优先事项是了解养殖系统的生态学，特别是那些可能对藻类生产力产生负面影响的生物的子集[3]。大规模的藻类生产不太可能在商业上取得成功，直到发现潜在的有害生物并制定管理策略[4,5]。

细菌在藻类生产系统中很丰富，通常达到1times;109个细胞mL^-1，比藻类细胞浓度高10-100倍[6]，已知一些细菌菌株可降低藻类生产力[7,8,9]。如果细菌有能力杀死藻类或抑制它们的生长，它们可能被认为是有害的。细菌可能降低藻类生产力的两种情况是，在较长的时期内，生产力逐渐下降，或导致活性分子迅速失败的突然影响，或“崩溃”。从概念上讲，细菌可能通过直接影响藻类或改变它们的环境而产生有害影响[10,11,12,13] 。在藻类生物制品工业最近扩张之前，大多数细菌与藻类的相互作用研究集中在自然环境中有害的藻类繁殖或非商业化生长的藻类，如衣藻[14, 15]。有限的研究已经做了为了确定精英藻类和细菌之间的关系，特别是在工程生产系统的环境中，包括营养丰富的条件包括了高细胞浓度环境。Rivas等人从布氏肉芽肿藻中分离出的细菌，将个别分离物重新接种到布劳尼氏杆菌的新培养中，并监测其对藻类生长的影响[13,16]。3种分离自根瘤菌属、不动杆菌属和假单胞菌属的分离物分别对布鲁木杆菌的生长有明显的促进、抑制和无影响作用。这证实了细菌在培养中可以以多种方式影响藻类的生产力。然而，对于最常见的商业菌株--如南绿藻、红球藻和杜氏杆菌--对于细菌对藻类生长的影响知之甚少。在此，实施了一项从工业藻类培养中分离细菌的协议，并鉴定了明显促进或抑制与商业相关的南绿藻或普通杂草藻类生长的细菌。分离出一株抑制两种南绿藻生长的细菌。经鉴定，该菌为一株芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。无细胞培养滤液对小叶南绿藻有抑制作用，表明抑制作用是由白叶蝉分泌的分子介导的。最后，芽孢杆菌不抑制普通杂草海藻四分体和普通小球藻的生长。因此，芽孢杆菌是一种潜在的有害细菌，可抑制与商业相关的菌株。

2.材料和方法

2.1细菌的分离

从性能不佳的室外200L工业生物反应器中收集10mL样品，由Solix Biosystems（柯林斯堡，CO）运营，其中拟球藻正在增长。将50-mu;L等分试样涂布在含有海洋琼脂（MA）的皮氏培养皿（Difco公司trade;海水琼脂2216;碧迪公司，富兰克林湖，新泽西州），将表型不同的菌落重新划线到新的MA平板上并在4℃下储存。

2.2 藻类和细菌的培养条件

在以30℃ ，200rpm搅拌下于6mL MB试管或100mL MB在250mL锥形挡板烧瓶中细菌分离的液体培养物在海洋肉汤中生长（MB;参见补充表1）（Difco公司trade;海水肉汤2216;碧迪公司，富兰克林湖，新泽西州）。

所有培养的微拟球藻CCMP（NCMA）1776，海洋富油微拟球藻CCMP（NCMA）526，普通小球藻（藻类分析，拉斯克鲁塞斯，NM）和四芨（分离株）[18]均在非缓冲人造海水培养基（ASW;参见表S1）中并暴露于50mu;Em-2s -1的24小时光下，在21℃的培养箱中以120rpm振荡。

原生藻培养物在250mL锥形瓶中以100mL的体积生长，并且用CytoOne T25培养瓶（USA Scientific，Ocala，FL）中的5mL培养基进行藻类抑制实验（不同于在24孔板中筛选）。 在6mL培养基中在150mL锥形瓶中进行实验，确定短小芽孢杆菌细胞浓度对藻类的影响。

2.3筛选藻类抑制性细菌

使用无菌吸头从MA平板上挑取分离的细菌菌落并接种到试管中的6mL MB中。 将培养物培养12小时，此时加入250mu;L每种细菌培养物的等分试样，以在750nm处的光密度复制750mu;L的盐生哈氏线虫，海洋富油微拟球藻，T. striata和C. vulgaris的培养物 （OD750）在24孔板（Corning，Corning，NY）中为0.5。 这些实验一式两份进行并重复几次。 除非另有说明，所有藻类培养物均在ASW中生长。将覆盖的24孔板中的培养物在室温下以120rpm振荡培养7天。 用培养物密度和绿色强度（叶绿素含量）每天监测藻类生长。

2.4细菌DNA提取，纯化，PCR扩增和测序

将来自过夜培养物的2毫升细菌细胞在12,000times;g下沉淀。去除培养基上清液并将细菌细胞沉淀在液氮中冷冻。在0.5mm氧化锆/二氧化硅珠（BioSpec Products Inc.）的存在下，通过在珠磨机（BioSpec Products Inc.）中振荡三次，每次1分钟来破碎细胞。根据制造商的说明，使用PowerSoil DNA分离试剂盒（MO BIO laboratories，Carlsbad CA）从该悬浮液中分离DNA。使用分光光度计（ND-1000 Thermo Scientific）以波长比260/280nm测定分离的DNA的浓度。随后，在含有终浓度10ng的模板DNA中，加入各0.5mu;M正向（5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和反向（5）引物的50-mu;L进行反应，使用PCR扩增了大约525nt所包含的16S rRNA基因。包括（--TACCGCGGCTGCTGGCAC-3）引物（Integrated DNA Technologies），1U High Fidelity Phusion DNA聚合酶（New England Biolabs），HF缓冲液和0.2mM dNTP（Fisher Scientific）。热循环包括在98℃初始变性2分钟; 40个循环的98℃变性30秒，55℃退火30秒和72℃延伸1分钟;最后在72℃延伸10分钟。使用琼脂糖凝胶电泳解析扩增子并在溴化乙锭染色后显现。使用上述引物，ABI BigDye Terminator v3.1化学（Applied Biosystems，Foster City，CA）和ABI 3130xL遗传分析仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）在美国科罗拉多州立大学蛋白质组学和代谢组学中对纯化的PCR产物进行测序设施。为了确定细菌身份，使用标准BLASTn针对GenBank 16S核糖体RNA序列询问回收的DNA序列。

2.5藻类和细菌浓度

用DU 730分光光度计（Beckman Coulter）测量，分别使用600nm和750nm的OD监测细菌和藻类的浓度。 此外，配备氩激光（488nm）和680 / 30nm带通滤波器的Guava easyCyte HT 流式细胞仪（EMD Millipore），用于测量基于大小和叶绿素荧光的藻细胞数量浓度。

2.6评估短小芽孢杆菌抑制海洋富油微拟球藻的小绿假单胞菌生长

在0.7-7.0的OD750下收获初生的海洋富油微拟球藻培养物，以2000times;g离心10分钟，并在ASW中重悬浮至约0.3-0.5的最终OD750。将4mL重悬浮的藻细胞的等分试样加入到每个T25烧瓶中。 将1毫升短小芽孢杆菌培养物以2000times;g离心5分钟，并将沉淀重悬于1毫升MB或ASW中。将重新悬浮的细菌加入到4mL的圣灵感染培养物中。对照培养物接受1mL等份的无菌MB或ASW，其缺乏短小芽孢杆菌（B.pumilus）。 监测藻类生长7天或8天。

为了测试较高的磷酸盐和铁浓度对短小芽孢杆菌介导的微拟球藻的抑制的影响，在250mL带挡板的烧瓶中将短小芽孢杆菌在MB中生长12小时，然后将细胞沉淀，重新悬浮在MB中，并将等分试样加入 在T25烧瓶中的N. gaditana培养物。 随后，每天向共培养物中加入0.88mM的KH 2 PO 4和0.37mM的FeCl 3·6H 2 O. 为了测试pH对短小芽孢杆菌抑制微拟球藻属的能力的影响，如上生长，收获短小芽孢杆菌细胞并将其加入N. gaditana培养物中。 共培养物的pH值每天调整两次，并使用5N NaOH和5N HCl维持在7或10天。

为了测试短小芽孢杆菌生长期对抑制小菜蛾生长的影响，短小芽孢杆菌在MB中生长7,12或24小时，分别对应于早期对数，晚对数和固定相（图1）。S1）。 在每个细菌生长阶段期间取出1毫升培养物，沉淀，重悬于1毫升MB中，并加入4毫升ASW中新鲜重悬的海洋富油微拟球藻培养物中。监测藻类生长7天。

为了确定短小芽孢杆菌细胞浓度对海洋富油微拟球藻生长的影响，将50-mL短小芽孢杆菌的亲本培养物在250-mL带挡板的烧瓶中以MB培养12小时。为了测定该培养物中菌落形成单位（CFU）的浓度，制备10倍系列稀释液并铺于MA平板上，温育24小时，并对得到的菌落进行计数。 将1毫升这些相同的稀释液离心，重新悬浮在1毫升MB中，并加入到4毫升新鲜重悬的海洋富油微拟球藻培养物中。在第0天，连续稀释的短小芽孢杆菌在共培养物中的浓度范围为2x10⁶至2x10⁹ CFU mL^-1。如使用流式细胞术所测定的，在第0天所有共培养物中，头孢噻呋菌的浓度平均为2.27times;107plusmn;0.11times;107个细胞mL^-1。使用流式细胞术监测共培养物的生长。

2.7确定无细菌滤液对海洋富油微拟球藻生长的影响

短小芽孢杆菌在250mL挡板烧瓶中生长7小时（早期对数）和（晚期平稳）32小时。 为了获得无细胞滤液，将细菌培养物通过0.22-mu;m无菌聚醚砜过滤器过滤。将藻培养物在2000times;g下沉淀10分钟，并重新悬浮由不同比例的短小芽孢杆菌滤液和ASW组成的5mL培养基：20％滤液，50％滤液或100％滤液。在T25瓶中培养培养物，通过OD750监测藻类生长7天。

2.8短小芽孢杆菌对藻类群落动态的影响

将来自指数增长的单克隆非洲钩端N.藻和T. striata培养物的藻沉淀并重新悬浮，最终OD750为0.5。使用流式细胞术定量藻细胞计数。将N. gaditana和T. striata在6-mL重复培养物中混合，以使得藻细胞百分比为100％T. striata或约95％N. gaditana加5％T. striata。对数期短小芽孢杆菌细胞收获，重新悬浮于MB中，并将1mL加入到150-mL锥形瓶中的藻类培养物中。对照培养物接受1mL无菌MB。通过流式细胞术监测藻细胞浓度7天。

3.结果与讨论

3.1分离抑制藻类生长的细菌

为了鉴别藻类培养中能改变精英或杂草藻类生长的细菌，开发了标准分离和筛选程序。 如图1A所示，将来自藻培养物的稀释样品铺在MA上，该MA是支持细菌生长的富营养盐的盐培养基。 分离的细菌在MB中生长至高密度，然后在具有精英（Nannochloropsis gaditana，Nannochloropsis salina）或杂草（Tetraselmis striata，Chlorella vulgaris）藻类的24孔板中共培养。 肉眼监测藻类生长，并且进一步表征在重复培养物中改变藻类生长的细菌。

在200-L闭式光生物反应器中停止，絮凝和起泡的工业盐藻培养取样后，回收了20种表型不同的细菌菌落类型。其中，单一细菌分离株似乎阻止了N. salina和N. gaditana的生长（图1B），如明显清楚的共培养物所示。为了确定这种细菌分离株的系统发育，对16S rRNA基因的一部分进行测序，并显示与506nt来自短小芽孢杆菌S10的16S rRNA基因具有99.2％的同一性。由于五个最相似的数据库条目代表短小芽孢杆菌变体，所以将来自藻类系统样品的分离物命名为短小芽孢杆菌菌株CSU001（GenBank KU860572）。为

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