蚯蚓堆肥和壳粉添加对Cd污染土壤中Cd生物有效性、酶活性和细菌群落的影响

原文作者：Feng Wang ^a, Weiwen Zhang ^a, Lijuan Miao ^a, Tianwei Ji ^b, Yifan Wang ^a, Hangjun Zhang ^a, Ying Ding ^a, Weiqin Zhu ^{a *}

单位：^a Key Laboratory of Hangzhou City for Ecosystem Protection and Restoration, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, China

^b General Station of Cultivated Land Quality and Fertilizer Management in Zhejiang Province, Hangzhou 310020, China

摘要：土壤中镉（Cd）污染日益严重，原位稳定化技术已广泛应用于土壤中重金属的修复。以目标堆制物添加量为3.0 kgbull;m^-2展开实验，分别为100%蚓粪（A1）；95%蚓粪 5%贝壳粉（A2）；95%蚓粪 5%贝壳粉改性物（A3）。研究其对土壤Cd生物有效性、酶活性和细菌群落的影响，并以生菜（Lactuca sativa L.）为供试作物种植在被Cd污染的农田土壤中。结果表明，施用目标堆制物提高了土壤pH、阳离子交换容量（CEC）、有机质（OM）、速效养分、过氧化氢酶（S-CAT）、蔗糖酶（S-SC）和脲酶（S-UE）的活性且显著降低了土壤中Cd的生物有效性，其中施用A3的土壤中Cd的生物有效性最低。土壤细菌丰富度和多样性增加，耐金属细菌增加，Proteobacteria、Acidobacteria和Gemmatimonadetes减少。另外，目标堆制物的施用促进了生菜的生长，抑制了生菜可食用部位对Cd的富集，且A3施用下Cd含量低于中国食品安全国家标准限值（Cd le; 0.2 mgbull;kg^-1）。因此，蚓粪与贝壳粉改性物混合制备的目标堆制物可作为Cd污染土壤的潜在修复材料。

简而言之，蚓粪和贝壳粉改性物混合制备的目标堆制物对Cd污染土壤具有良好的修复效果。

关键词：Cd生物有效性；酶活性；土壤细菌群落；贝壳粉；蚓粪

1. 引言

随着城市化和工业化进程的加快，采矿、冶炼、农业灌溉、农药和废弃物的使用等人类活动导致了大量的重金属释放到土壤中（Seleiman et al., 2012; Tang et al., 2019; Wei and Yang, 2010）。重金属通常是不可降解的，很难从土壤中去除（Rizwan et al., 2016），并且它还可以通过食物链进而影响人类健康（Seleiman et al., 2020a, 2020b）。据报道，我国农田土壤总污染率为10.18%，主要由Cd、Cu和Zn污染引起（Cheng et al., 2018）。其中，Cd以其高毒性和高流动性在农业土壤中引起了广泛的关注（Rizwan et al., 2016）。因此，对Cd污染土壤的治理迫在眉睫。目前，重金属污染土壤的治理方法主要有两种。一种方法是通过客土换土法、电动技术或淋洗技术去除土壤中的重金属（Malik et al., 2015），但该方法成本高，影响农业生产，不适合大规模农田土壤修复（Houben et al., 2013）。另一种方法是利用原位固定化技术降低作物中的重金属含量，由于其成本低、效率高、操作简单而得到广泛应用（Zhou et al., 2014）。原位固定技术通过重金属离子的吸附、沉淀、络合和交换，向土壤中添加材料来降低重金属的生物有效性（Zhang et al., 2019）。然而，要实现大规模农田重金属污染土壤的安全利用，原位固定化技术的关键是选择具有稳定效果但不存在二次重金属污染风险、价格低廉的阻控材料。

蚓粪是蚯蚓堆肥过程中分解有机物的最终产物，因其腐殖质含量高，具有良好的通气、排水和保水能力（Tejada et al., 2010），常被用作提高作物产量的土壤有机肥。它具有较大的比表面积、较高的阳离子交换能力和丰富的活性官能团，是一种较好的土壤重金属稳定材料（Ding et al., 2021; Wang et al., 2018）。同时，石灰、金属氧化物、贝壳粉和贝壳粉改性物等无机矿物因具有良好重金属稳定效果而受众多关注（Rizwan et al., 2016; Islam et al., 2017）。贝壳粉是一种来源广泛的石灰类生物无机矿物，其具有较大的比表面积和良好的吸附重金属能力，而改性贝壳粉可通过在一定温度下煅烧后轻易获得，其相较于贝壳粉含有更多的孔径、更大的比表面积及更高的重金属吸附率（Ok et al., 2010）。与单一的材料相比，复合材料通常被认为更适合于重金属污染土壤的稳定化修复。例如，有报道称，使用蚯蚓堆肥和石灰作为土壤改良剂可以显著降低Cu对葡萄植株的毒性（Trentin et al., 2019）。然而，尽管蚓粪与贝壳粉或改性贝壳粉复合材料可以以较低的成本改善植物生长和达到重金属污染土壤稳定化，但其对Cd的生物有效性尚不明确。

此外，有研究表明，土壤阻控剂可以通过减少重金属生物有效性来提高土壤酶活性（Garau et al., 2019），或通过改变土壤的理化性质来影响酶的稳定性（Yang et al., 2016），因此除作物中重金属含量和土壤中重金属生物有效性可用于评价土壤阻控剂的应用效果外（Hamid et al., 2019），土壤酶活性也是一个重要指标可用来评价土壤生态功能（Tang et al., 2020）。微生物群落亦被认为是土壤生态功能的重要指标，可以间接反应土壤阻控剂对重金属的修复效果（Elzobair et al., 2016）。现有研究表明，阻控剂的施用会显著影响土壤微生物群落的多样性和结构，但效果不确定，不同阻控剂、不同土壤类型和不同的管理策略得到的结果有很大差异（Kelly et al., 2014; Wang et al., 2015）。因此，为了更好的评价复合阻控剂的应用效果，亦有必要确定复合阻控剂施用对土壤微生物的影响是否有益。

在本研究中，设A2和A3作为大田土壤的复合改良剂，添加量为3 kgbull;m^-2，目的如下：(1)测定其对土壤理化性质、Cd生物有效性、酶活性和细菌群落的影响；(2)探讨A2和A3施用条件下土壤理化性质、Cd生物有效性与细菌群落变化的关系；(3)实现Cd污染土壤中生菜（Lactuca sativa L.）的安全生产。探究蚯蚓粪与贝壳粉或改性贝壳粉复合阻控剂是否可以改善土壤理化性质、酶活性和细菌群落，降低Cd污染土壤的Cd毒性，抑制生菜（Lactuca sativa L.）Cd积累。本研究结果有望为Cd污染土壤的安全利用提供科学依据。

2. 材料和方法

2.1 试验位置

田间试验位于中国浙江省富阳市春华镇某农田（北纬30°05′，东经119°90′）开展，该地属亚热带季风湿润气候，年平均气温19.1 ℃，春季降水426.80 mm（根据杭州市气象局）。田地里的土壤为黏土类土壤，受农药、化肥以及灌溉被重金属污染的污水，导致该地土壤存在重金属污染现象。土壤基本理化性质为：pH值为4.78，CEC为12.2 cmolbull;kg^-1，OM含量为1.93%，总Cd为0.68 mgbull;kg^-1。根据《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准》（GB 15618-2018），当pH lt; 5.5的土壤中Cu、Zn、Pb和Cd土壤污染风险筛选值分别为50、200、70和0.3 mgbull;kg^-1。因此，该田间试验土壤Cd污染程度为中度。

2.2 试验材料及设计

蚓粪取自浙江与牧生物科技有限公司；贝壳粉和贝壳粉改性物是从河北某矿场加工厂购买获得的。贝壳粉主要成分为CaCO₃（90%~95%），贝壳粉改性物的主要成分主要为CaO（90%~95%）。试验设置3个目标堆制物处理，分别为A1，100%蚓粪；A2，95%蚓粪 5%贝壳粉；A3，95%蚓粪 5%贝壳粉改性物。其pH分别为6.3、7.01、8.42；CEC分别为346、372、404 cmolbull;kg^-1；OM分别为50.5%、48.5%、47.9%。A1、A2、A3中Cd含量分别为0.25、0.22、0.20 mgbull;kg^-1，远低于中国有机肥料中Cd（le; 3 mgbull;kg^-1）的最高允许限量标准（NY525-2012）。

本试验是参照Liu and Chen（1979）的田间小区设计要求进行的。2019年5月20日，随机建立了12个试验小区（1.9 m times; 4.2 m），相邻小区之间设置≧0.15 m宽的间隔。试验设置4个处理，不添加（CK）、添加A1（T1）、添加A2（T2）和添加A3（T3），每个处理均设3个重复，目标堆制物添加量为3.0 kgbull;m^-2，将目标堆制物与10~20 cm深的表层土壤充分混合。选用生菜（Lactuca sativa L.）即意式生菜作为供试作物。试验期间，根据当地种植习惯进行田间管理。

2.3 样品采集及预处理

样品于2019年6月28日采集。每个小区随机挑选10株生菜。将植物样品运送到实验室后，对植物可食用部分进行清洗、吸干、称重。将样品于65 ℃下烘干至恒重，将干燥的样品磨碎后，过0.15 mm筛后保存待测。同时，采集个表层土壤样品（0~20 cm），充分混合，然后将土壤样本分为2个子样本，其中一个子样本置于室温下风干，粉碎后通过0.15 mm筛进行理化分析，另一个子样本置于-80℃冰箱下冷冻用于微生物特性分析。

2.4 土样分析

2.4.1 理化性质

土壤基本理化性质分析参照Lu介绍的方法。使用pH计（Mettler Toledo Delta 320, Switzerland）测量pH、CEC测定采用BaCl₂-H₂SO₄交换法；OM含量采用K₂Cr₂O₇-H₂SO₄氧化比色法测定；土壤碱解氮（AN）采用碱性水解扩散法测定；土壤速效磷采用钼锑反分光光度法测定；土壤速效钾（AK）采用乙酸铵溶液进行提取，并使用原子吸收分光光度计（Shimadzu AA-6800, Japan）进行测定。

2.4.2 Cd分析

根据Lindsay和Norvell（1978）的方法采用DTPA萃取法分析有效Cd，根据Lu（2000）的方法用HNO₃-HClO₄混合溶液消化土壤（0.45 g）分析总Cd。采用等离子体发射光谱仪（Prodigy 7, Leeman Labs, America）对Cd提取液进行测定。Cd生物利用度指数（Cd-BI）的计算公式如下：Cd-BI(%) =有效Cd含量/总Cd含量times;100%。

2.4.3 土壤酶活性分析

根据Yang et al.（2011）的方法，采用紫外分光光度法分析土壤过氧化氢酶（S-CAT），以每克土壤分解的H₂O₂的量表示过氧化氢酶活性。用0.1 molbull;L^-1 Na₂S₂O₃溶液滴定测定土壤蔗糖酶（S-SC）活性，用每克土壤消耗0.1 molbull;L^-1 Na₂S₂O₃量表示。用C₆H₅ONa染色测定脲酶（S-UE）活性，用1.0 g土壤中释放的铵量表示。酸性磷酸酶（S-ACP）活性是根据磷酸苯二钠转化为苯酚来测定的，其活性以1 g土壤中苯酚释放毫克数来表示（Li et al., 2008）。

2.4.4 细菌群落分析

根据使用说明书，使用E.Z.N.A.trade;Mag-Bind土壤DNA试剂盒（Omega, USA）从500 mg新鲜土壤中提取土壤DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。使用341F（5 0- cctacgggnggcwgcag3 ）和805R（5 - gactachvgggtatctaatcc -3 ）引物对16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增。PCR产物送至Illumina MiSeq平台（Sangon Bioengineering Co., LTD, Shanghai, China）进行测序。根据Liao等（2013）的方法对原始序列进行优化后，按照97%相似性对序列进行聚类。在与Silva数据库比较的基础上，通过RDP classifier进行物种分类。Alpha多样性指数（Chao, ACE, Simpson和Shannon）由MOTHUR（version 1.30.1）计算。采用Canoco 4.5（Microcomputer Power Co., USA）进行冗余分析（RDA），揭示细菌群落与环境因素之间的整体相关性。

2.4.5 植物样品分析

叶绿素含量测定采

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