在生产规模旋转生物接触器中，生物膜中微生物群落、硝化器和脱氮器的变化

原文作者：Xingxing Peng, Feng Guo, Feng Ju, and Tong Zhang*

单位：Environmental Biotechnology Laboratory, Department of Civil Engineering, The University of Hong Kong SAR, China

摘要：

本研究的目的是研究在两个旋转生物接触器（RBC）序列的生物膜中微生物群落，尤其在塞式流道上的运行时间不同的硝化菌和反硝化菌的变化。使用多种方法对微生物群进行了分析，包括对16S rRNA基因的焦磷酸测序、克隆文库和定量聚合酶链反应（qPCR）。结果表明：（1）不同地点的整体微生物群落具有不同的模式，即在两个旋转生物接触器序列的起始处有相似的微生物群落，在两个旋转生物接触器序列的末端有完全不同的种群；（2）硝化细菌，包括氨氧化古细菌（AOA）、氨氧化细菌（AOB、Nitrosomonas）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB、硝基螺旋菌），在沿流道的生物膜中相对丰度增加，而反硝化细菌（红细菌、副球菌、Thauera和氮细菌）显著减少；（3）在所有采样断面中，AOA次优势于AOB；（4）不同细菌之间存在强烈的生态关联。总的来说，这项研究的结果提供了更全面的关于全规模旋转生物接触器中生物膜群落组成和组装的信息。

1 引言

脱氮，包括硝化和反硝化过程，是污水处理厂最重要的目标之一。旋转生物接触器（RBC）是一种利用生物膜中的固定化微生物作为催化剂，触发一系列生物反应，以去除包括氮在内的污染物的系统^[1~6]。与其他处理工艺相比，此类系统的土地需求较少，对温度的敏感性与能耗都处于较低水平，因此得到了广泛应用。

在RBC中，附着在圆盘表面的生物膜和废水中污染物的同化在废水处理过程中起主导作用。最近有研究报道了几种特定的硝化菌和反硝化菌^[7~12]；然而，与其他废水生物处理系统相比，RBC中的生物膜群落组成的特征非常不明显。

近几十年来，基于微生物16S rRNA的分子技术，包括荧光原位杂交（FISH）^[7~10]、变性梯度凝胶电泳（DGGE）^[9,11]、qPCR^[12]和克隆文库已被用于分析RBC生物膜中的脱氮细菌和有机物去除细菌。Sauder等人^[12]使用定量PCR和PCR-DGGE技术调查了氨氧化菌群，包括城市污水处理厂RBC生物膜中的氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古细菌（AOA），并观察到氨梯度决定了AOA和AOB的相对丰度。最近，454焦磷酸测序技术通过大规模并行测序产生大量中等长度的DNA读数^[13]，已被用于全面测定不同环境样本中的细菌群落，包括海洋、土壤和活性污泥^[14~16]。

本研究从香港马湾污水处理厂的全规模RBC不同部位采集生物膜样品。对16S rRNA基因进行焦磷酸测序，基于线性采样策略在门、属和种的水平上分析细菌生物膜群落，以分析RBC处理路径上的细菌群落的变化。此外，还进行了qPCR和克隆文库分析，以检测AOA和AOB amoA序列的相对丰度和多样性。此外，还评估了RBC不同部分之间的相似性与差异性，并确定了这些功能细菌之间的相关性。作为焦磷酸测序在这方面的首次应用，我们对RBC中的细菌群落进行了更全面的分析，并发现了一种与污染物去除相关的变化模式。

图 1旋转式生物接触器原理图、取样名称和位置。从第二组（A组）采集RBC-A-1至RBC-A-7样本，从第四组（B组）采集RBC-B-1至RBC-B-7样本。从RBC-A-1a到RBC-A-1c以及从RBC-B-7a到RBC-B-7c的样本分别位于A组的第一个圆盘和B组的第七个圆盘中。

2 材料与方法

2.1 样品收集

从香港马湾污水处理厂的两组旋转生物接触器（A组和B组）共采集十八个样品，该厂平均每天处理7600 m³的城市污水（图1）。从A组和B组处理序列的所有阶段收集样品，其中，A组已经运行了6个月，而B组已经运行了1个月。所有生物膜样品通过铝金属板（15times;20times;0.2 mm）收集，然后浸入含有70%乙醇的50 mL离心管中。收集RBC各阶段的水样，并将其放入冰上的无菌塑料管中（图1）。此外，所有生物膜样品的混合物被准备用于克隆文库的构建。

2.2 水质化学分析

使用总有机碳分析仪（岛津TOC-VCPH，日本京都）测定总有机碳（TOC）。化学需氧量（COD）采用标准重铬酸钾滴定法测定^[17]。NH₄ -N和NO₃^--N根据《水和废水检测标准方法》进行测定。使用pH计（Thermo Orion 4 Star，美国贝弗利）测定pH值。

2.3 DNA提取、PCR扩增和焦磷酸测序

将所有生物膜样品用0.85%NaCl溶液在4 ℃下以4000 rpm、12 min的条件洗涤两次，并使用FastDNA土壤旋转试剂盒（Q-Biogene，CA）提取DNA^[18]。使用以下引物扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区（约420 bp）：正向5′-ACTCCTACGGGGAGGAGCAG-3′和反向5′-TACNVGGTATCTATCC-3′。将用于复用的条形码插入正向引物和454适配器序列之间^[19]。反应在i-Cycler（BioRad Hercules, CA）上进行，循环条件如下：94℃初始变性5分钟，然后94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸60秒，72℃最后延伸10分钟。PCR扩增后，三个重复的PCR产物被混合，并用PCR快速旋转试剂盒（iNtRON Biotechnology，韩国）进行纯化。利用NanoDrop设备（ND1000）和电泳分别对DNA浓度进行量化，并验证片段的长度。然后，PCR产物被送往香港大学基因组研究中心，在罗氏454 FLX Titanium平台（Roche，Nutley，NJ）上进行焦磷酸测序。

2.4 焦磷酸测序数据处理

焦磷酸测序的原始序列基于Mothur v 1.25.0分析管道进行处理^[20]。经过解复用、质量微调和校准后，嵌合体序列被移除，最后用ChimerSlayer算法进行核验。采用RDP建议的自举分界线（80%），将序列分配到不同的分类级别。Goods coverage被用来剩余的序列被归入属和种水平的操作分类单位（OTU），分别使用97%和98%的同一性阈值，使用微生物生态学定量分析（QIIME）工具包^[21]，这些序列也使用RDP分类器被分配到相应的分类等级。衡量捕获的多样性，计算公式为G=1-n/N，其中n是单个OTU的数量，N代表序列的总数。

通过使用SPSS软件评估Pearson相关系数^[22,23]，评估焦磷酸测序方法的测序重复性。我们研究的目标再现性是通过找到至少为0.8的充分相关系数来计算的^[24]。

2.5 AOA和AOB amoA基因的克隆和测序

研究RBC中amoA多样性（包括AOA和AOB）的克隆库是通过提供比454焦磷酸测序提供的更长的序列读数来构建的。引物在SI表S1中描述，实验是按照以前的研究进行的^[25]，共对50个克隆进行了AOA和AOB测序。

2.6 定量PCR（qPCR）

qPCR在25 mu;L反应体系中进行，该反应包含12.5 mu;L Maxima SYBR Green qPCR主混合物（Thermo）、10 pmol各个引物（SI表S1）、20 ng DNA模板和超纯无菌水。每个样品有三个重复，所有qPCR均在配备iCycler iQ软件（Bio-Rad，宾夕法尼亚州费城）的iCycler热循环仪上进行。PCR方案为95 ℃、1 min后进行的45个循环，循环包括：在95 ℃下10 s，在56 ℃下20 s，在72 ℃下1 min，然后在72 ℃下50秒 s，除了退火温度（58 ℃）外，AOB amoA基因的PCR条件相同。根据标准曲线的相关系数（R² = 0.995），说明结果有效。

2.7 统计分析

聚类分析（CA）和UniFrac主坐标分析（PCoA）是将观察结果分为相似的组或集的统计技术。CA基于分类结果和操作分类单位（OTU），而PCoA基于RDP分类器结果、OTU和UniFrac，UniFrac是一种依赖系统发育的方法，使用系统发育信息来比较不同的样品^[26]。这两种分析都是使用PAST软件实现的^[27,28]。

细菌共现模式的网络分析可以有效地揭示环境样品中潜在的细菌相互作用^[29]。在本研究中，计算了1949个OTU（从6457个OTU中筛选）之间所有成对的Spearmans等级相关性，过滤后留下370个OTU，只保留Spearmans相关系数rho; gt; 0.6和P值 lt; 0.01的OUT^[30]。前面这个过滤步骤除去了代表性差的OTU，也降低了网络的复杂性，有利于核心群体的形成。节点代表了重建网络中97%身份的OTU，而边缘则描述了节点之间强烈而重要的相关性。还计算了其他一些参数，如平均节点连通性、直径、平均路径长度、聚类系数和模块化指数等。所有的统计分析都是用R的操作功能和正包进行的，Gephi平台被用来探索和可视化网络^[31]。

3 结果与讨论

3.1 RBC的污染物及物理化学梯度

在整个实验过程中，有机碳和NH₄ -N的浓度普遍沿RBC处理路径降低（表1）。总的来说，RBC系统对废水的处理能力在可接受的范围之内，TOC（80%）、COD（85%）和NH₄ -N（96%）的去除率都较为理想。这些结果与之前的研究一致，均显示了RBC处理路径下的去除效率^[4~6]。实验数据显示RBC过程中不同阶段的废水pH值先降低后升高，其中pH值降低可能是由于氨氧化过程中的碱度消耗，而RBC后期的pH值升高则是源于碱度的恢复^[32]。随着NO₃^--N（5.6 - 17.7 mg/L）的增加，RBC后期的反硝化过程可能会减少。

表 1从RBC水样中获得的废水参数摘要^a

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