四环素类抗生素具有水溶性好、化学性质稳定、治疗效果好以及广谱性、质优、价廉等优点，在水产养殖业中应用非常广泛，以亚治疗剂量添加于动物饲料中用于动物疾病的预防和促进动物生长。也广泛适用于水产养殖中各种疾病的防治，但是盲目使用和滥用抗生素而造成的抗性基因污染问题也越来越严重,进而致了细菌耐药性。抗性基因一旦被排泄到水产环境中不仅会对养殖区域和周围环境造成潜在的基因污染，而且还会通过各种分子和遗传水平进入到其他致病菌和环境细菌中，衍生出超级细菌等，这些抗性微生物和抗性细菌基因可以通过直接或间接接触的方式进入人体，增强人体的耐药性，从而给人类公共健康造成威胁。因此研究抗生素抗性基因及其污染现状、扩散和传播规律是非常必要的。

在水产养殖中对细菌性疾病的控制还是主要靠抗生素，相同疗效的替代产品还较少，因此，使用抗生素仍是目前水产养殖中防病治病的首要选择。但是，目前在农业部主导的养殖业抗生素使用监管中，既缺乏明确的相关立法，也没有权责划分明确的专业监管机构。自从Pruden等第一次提出将抗性基因作为环境中一种新型污染物，抗性基因的危害便在世界范围内引起了高度重视。

水产养殖是抗生素抗性基因进入水环境最直接的途径，本文通过对河蟹养殖水环境的四环素类抗性细菌和抗性基因进行初步研究，揭示水产养殖水体中主要抗性基因和抗性细菌在养殖生态系统中的暴露水平、扩散和传播规律，以期综合评价抗生素抗性基因的环境生态风险。

自1983年以来，一些发达国家，如德国、美国、西班牙、韩国等已经陆续在土壤、水体等环境中检测到四环素药物的存在。Miranda等（2003）从智利的4个鲑鱼养殖场分离出25种不同的抗四环素革兰氏阴性菌，44%的菌株携带 tet（A）、tet（B）或 tet（E）基因。Gao等在天津地区的水产养殖场中检测出多种抗性基因( tetM、tetO、tetT、tetW、sul1 及sul2)。Di Cesare等在地中海沿岸的养鱼场中发现了tetM、tetO、tetL、tetK、ermB、ermA 和 ermC 等多种抗性基因，但该渔场并没有在饲料中添加任何抗生素，这说明该渔场中的抗性基因可能是由于海水养殖促进了抗性基因的水平转移。Ｒeboucas等在巴西的一个养虾场中也发现了对氨苄青霉素和四环素均具有抗性的致病性弧菌。

Furushita等（2003）在日本3个不同的渔场采集的鱼中检测出抗四环素菌株，结果显示鱼的菌株中携带的抗四环素基因的序列和从人类临床分离的菌株中存在的抗四环素基因的序列呈现出高度的相似性。Rhodes等（2000）研究发现土霉素抗性质粒在水产和医院分离的菌株之间发生了转移，这为抗性质粒在气单胞菌和大肠杆菌中转移提供了直接的证据。这些资料充分说明水产环境中的抗性菌可能会将抗性基因传播到人体内病原菌，使人致病菌携带抗性。

随着各种抗生素的滥用，细菌对抗生素的抗药性已由单一抗药逐渐发展为多重抗药，目前的研究也发现大部分抗性菌株表现为多重抗药性。多重抗药（Multiple Drug Resistance，MDR）系指一种微生物同时对多种常用的抗生素类药物产生抗药性（张伟等，2008）。已有很多研究报道在水产养殖场的动物体内和环境中发现多重抗药菌株的存在。李军等报道香港养殖海绷弧菌对氨节青霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素和三甲氧节胺喻喧等具有很强的耐药性。Jun等（2004）从韩国患流行病的养殖鱼（包括比目鱼和鳗鱼）体内分离得到127个临床菌株，其中有20个抗四环素的爱德华迟钝菌株，经分析发现20个菌株都具有多重抗药性，除了抗四环素外，这些菌株对恶喹酸、萘啶酸、氯霉素、氨比西林、卡那霉素和链霉素等抗生素也有抗性。由此可见在使用过抗生素的环境中普遍存在着多重抗药性菌株。因此,研究养殖场及其周围环境中四环素类抗生素抗性基因及其扩散和传播规律等很有必要性。

实行方案：

1.采集样品并处理样品

2.进行四环素类抗性细菌耐药性实验

3.水样和沉积物中四环素耐药性细菌基因组DNA提取实验

4.四环素类抗性细菌菌种鉴定实验

5.四环素类抗性基因荧光定量PCR检测

进度：

2015年12月，查阅相关文献

2016年2月，撰写开题报告

2016年3-4月，进行相关实验研究、分析数据

2016年5月，撰写实验论文、得出结论

预期效果：

通过实验对该课题进行探索，比对实验结果与文献结论，提高实验操作技能及分析能力，更加深刻地了解该课题。

1.Gao P, Mao D, Luo Y, et al. Occurrence of sulfonamide and tetracycline-resistant bacteria and resistance genes in aquaculture environment. Water Research, 2012 (46), 2355-2364.

2.GAO Pan-pan，LUO Yi1，ZHOU Qi-xing，MAO Da-qingAsian Journal of Ecotoxicology Vol. 4, 2009 No. 6, 770-779

3.LIANG Xi-mei，NIE Xiang-ping，SHI Zhen ENVIRONMENTAL SCIENCE

Vol． 34，No． 10 Oct． ，2013

4.WEN Han-qing，SHI Jun，XUN Hao，DENG Hui-ping ( College of Environmental Science and Engineering，Tongji University，Shanghai 200092，China) ． -Chin． J． Appl． Ecol．， 2015，26( 2) : 625－635．

5.Pruden a, Pei R, STORTEBOOM H, etal. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: Studies in Northern Colorado [J]. Environmental Science and Technology, 2006, 40: 7445-7450.

6.Di Cesare A，Vignaroli C，Luna GM，et al． Antibioticresistant Enterococci in seawater and sediments from a coastal fish farm． Microbial Drug Ｒesistance，2012，18: 502－509